潘瑞 劉樹楓 王佳文 倪晉仁

南水北調(diào)中線工程水源區(qū)抗生素抗性基因多樣性研究

潘瑞 劉樹楓 王佳文 倪晉仁?

北京大學(xué)環(huán)境工程系, 北京 100871; ?通信作者, E-mail: nijinren@iee.pku.edu.cn

為了研究丹江口水庫和漢江抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs)的污染現(xiàn)狀與分布規(guī)律, 采用高通量測(cè)序的方法, 于 2014 年春季和秋季分別對(duì)丹江口水庫及漢江沿程的 ARGs 多樣性進(jìn)行檢測(cè)。分別在春秋兩季樣本中檢測(cè)出 21 和 19 類 ARGs, 其中 9 類 ARGs 是水體 ARGs 的主要組成部分。桿菌肽類 ARGs 是水體中最主要的 ARGs, 而-內(nèi)酰胺類 ARGs 在春季丹江口水庫陶岔采樣點(diǎn)中占比最高。秋季水體各采樣點(diǎn)的ARGs 組成結(jié)構(gòu)差異比春季小, 通過 NMDS 和 ANOSIM 分析發(fā)現(xiàn) ARGs 的組成存在顯著的季節(jié)差異, 甲氧芐氨嘧啶類、多粘菌素類和多重耐藥類 ARGs 是具有顯著季節(jié)差異的 ARGs 種類。由相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn) 13 類具有互相顯著強(qiáng)相關(guān)關(guān)系的 ARGs, 其中相關(guān)性最強(qiáng)的 ARGs 很可能共存于一種微生物中。此外, 四環(huán)素類和氨基糖苷類 ARGs可能作為預(yù)測(cè)水源區(qū)中與其共存 ARGs 相對(duì)豐度的指示種類。研究結(jié)果可為飲用水源區(qū)的水質(zhì)保護(hù)和 ARGs 污染防治與管理提供科學(xué)依據(jù)。

飲用水源; 抗生素抗性基因; 季節(jié)差異; ARGs相關(guān)關(guān)系

飲用水安全對(duì)人類的健康至關(guān)重要, 是環(huán)境保護(hù)的重要組成部分[1]。飲用水源(如河流、水庫等)的水質(zhì)安全是飲用水安全中的重要環(huán)節(jié)[2]。飲用水源水質(zhì)檢測(cè)指標(biāo)包括微生物群落[3]、重金屬[4]和藥物殘留物[5]等, 其中抗生素檢測(cè)受到越來越多的關(guān)注?？股厥且环N用來治療和防止細(xì)菌感染的抗菌藥物[6], 目前主要用于治療和預(yù)防人類或動(dòng)物疾病, 也作為飼料添加劑來促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育[7]。但是, 生物體并不能完全代謝抗生素[8], 其隨污水進(jìn)入污水處理廠后, 也不能被完全去除[9]。例如, 在香港兩個(gè)污水處理廠發(fā)現(xiàn), 抗生素的平均去除效率只有26%~68%[10]。殘留抗生素會(huì)進(jìn)入自然水體, 威脅飲用水源的安全[11]。

抗生素的濫用和誤用造成的選擇壓力會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中具有抗生素抗性和攜帶抗生素抗性基因的細(xì)菌數(shù)量大量增加[12–13]?？股乜剐曰?antibiotic resistance genes, ARGs)是一種新興的環(huán)境污染物[14],廣泛存在于湖泊[15]、污水處理廠[16]、飲用水廠[17]和農(nóng)業(yè)土壤[18]等各種環(huán)境中。江月等[19]在長江下游某水源型水庫水體中檢測(cè)出 118 種 ARGs, 沉積物中檢測(cè)出 124 種 ARGs, 其中-內(nèi)酰胺類、多重抗藥類等 54 種 ARGs 為水庫中占主導(dǎo)的 ARGs。Be-rgeron 等[20]在美國路易斯安納州東南部水源中檢測(cè)出四環(huán)素類和磺胺類 ARGs?？股乜剐约?xì)菌可以通過水平基因轉(zhuǎn)移或增殖傳播 ARGs, 釋放的 ARGs會(huì)轉(zhuǎn)移至包括致病菌在內(nèi)的其他細(xì)菌中。環(huán)境中抗生素抗性細(xì)菌和 ARGs 對(duì)人類健康的影響, 在一定程度上比微量殘留的抗生素危害更大[21–22], 因此檢測(cè)飲用水源中的 ARGs 至關(guān)重要。

南水北調(diào)工程是解決我國水資源分布不均及區(qū)域缺水問題的重大戰(zhàn)略工程[23], 其中線工程從丹江口水庫陶岔閘引水, 承擔(dān)為京、津、冀、豫四省市調(diào)水的任務(wù)[24]。漢江發(fā)源于陜西寧強(qiáng)縣, 于白河縣流入湖北境內(nèi), 在十堰市丹江口與其支流丹江匯合, 最終于武漢市匯入長江[25]。丹江口水庫年來水量的 90%都源于漢江[26], 而水庫也會(huì)影響漢江中下游的水量和水質(zhì)。漢江和丹江口水庫是南水北調(diào)中線工程以及漢江中下游地區(qū)重要的水源區(qū), 但高人口密度和人類活動(dòng)對(duì)其水質(zhì)有一定程度的影響[27–28], 因此有必要對(duì)其 ARGs 的污染現(xiàn)狀展開研究, 為飲用水源區(qū)的保護(hù)提供支持。

1 研究方法

1.1 采樣點(diǎn)布置與樣本采集

沿漢江自陜西省安康市至湖北省武漢市布置 6 個(gè)采樣點(diǎn)(圖1), 分別為白河(BH)、丹江口壩下(DJK)、陶岔(TC)、襄陽(XY)、仙桃(XT)和集家嘴(JJZ), 其中陶岔位于丹江口水庫內(nèi)。

本研究于 2014 年春季(3 月)和秋季(10 月)采集水體樣本。按照采樣季節(jié)與樣本性質(zhì), 將樣本分為春季水體組(Water_Spring samples)和秋季水體組(Water_Autumn samples)。對(duì)每個(gè)采樣點(diǎn), 分別使用 5L 無菌PE瓶, 采集 10L 水樣并立即送往臨近實(shí)驗(yàn)室, 于 0~4°C 保存, 在 24 小時(shí)之內(nèi), 使用 0.22 μm 聚碳酸酯濾膜(Millipore, 美國)過濾全部水樣, 并將濾膜置于?80°C冰箱中保存。

1.2 DNA 提取與高通量測(cè)序

用無菌鑷子夾取 1~2 張濾膜, 置于 2 mL 無菌離心管中, 用液氮速凍后破碎, 參照標(biāo)準(zhǔn)流程, 使用FastDNA?SPIN Kit for Soil 試劑盒(MP Biomedicals, 美國)提取 DNA。每個(gè)樣本進(jìn)行多次提取后混合。使用 1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, 美國), 分別檢測(cè) DNA 的完整性及其濃度和純度[29]。將所有 DNA 樣品置于干冰中保存, 送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司, 用 Illumina Hiseq 4000 平臺(tái)(Illumina, 美國)進(jìn)行雙端測(cè)序, 每個(gè)樣本的下機(jī)數(shù)據(jù)不小于 20 GB。

1.3 ARGs檢測(cè)與相對(duì)豐度計(jì)算

采用 Sickle[30]和 NGSQC Tool kit[31](v2.3.3)對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù) raw reads 進(jìn)行質(zhì)量控制, 去除低質(zhì)量數(shù)據(jù), 得到 clean reads。使用 DIAMOND[32], 將 clean reads與 ARGs 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)(https://bitbucket.org/gusphdproj/deeparg-ss/downloads/), 比對(duì)參數(shù) E-value 為10?10。按照相似度≥90%, 匹配上的氨基酸數(shù)量≥25個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)篩選 ARGs[33]。

由于數(shù)據(jù)庫中不同 ARGs 的參考序列長度不同, 采用下式[34]對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化:

其中,類ARG序列是檢測(cè)為某一種特定 ARG 的 clean reads 數(shù)量;reads為高通量測(cè)序中 clean reads 的長度, 本研究中春季樣本均為 100 個(gè)堿基, 秋季樣本均為150 個(gè)堿基;ARG參考序列為這一種特定 ARG 參考序列的長度;16S序列是在高通量測(cè)序中識(shí)別的 16S 序列數(shù)量[29];16S序列是 Greengene 數(shù)據(jù)庫中 16S 序列的平均長度 1432bp[34–35]。計(jì)算出的 ARGs 相對(duì)豐度單位為 ARG 拷貝數(shù)/16S rRNA 拷貝數(shù)(簡稱ratio)[34]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用 R 語言(v3.4.4) pheatmap 包繪制 ARGs 相對(duì)豐度熱圖, 使用 R 語言 vegan 包對(duì) ARGs 相對(duì)豐度進(jìn)行非度量多維標(biāo)度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)和相似性(analysis of similarities, ANOSIM)分析與作圖。使用 STAMP[36](v2.1.3)進(jìn)行組間差異分析, 使用 SPSS 18.0 進(jìn)行 spearman 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs 的種類與相對(duì)豐度

在春季和秋季水體樣本組分別檢測(cè)到 21 類和 19 類 ARGs, 相對(duì)豐度如圖 2 所示。春季和秋季樣本組的 ARGs 總相對(duì)豐度范圍分別為 8.29×10?2~ 3.38×10?1和 6.35×10?2~1.43×10?1ratio。在春季和秋季樣本組都檢測(cè)出 18 類相同的 ARGs, 平均相對(duì)豐度范圍分別為 2.86×10?5~7.91×10?2和 3.58×10?6~6.51 ×10?2ratio, 占各自樣本組中所有 ARGs 平均相對(duì)豐度總和的 99.983%和 99.997%。春季樣本組中有 3 類獨(dú)有的 ARGs, 分別是氨基香豆素類(amino-coumarin, 相對(duì)豐度為 9.34×10?6~6.69×10?5ratio)、肽類(peptide, 僅在 XY 采樣點(diǎn)檢測(cè)到, 相對(duì)豐度為1.14×10?5ratio)和截短側(cè)耳素類(pleuromutilin, 僅在DJK 采樣點(diǎn)檢測(cè)到, 相對(duì)豐度為 1.39×10?5ratio), 特曲霉素類(tetracenomycin) ARGs 則只在秋季樣本組的 DJK 采樣點(diǎn)檢測(cè)到, 相對(duì)豐度為 1.33×10?5ratio, 可以看出, 春季和秋季樣本組獨(dú)有的 ARGs 相對(duì)豐度很低, 而兩組共有的 18 類 ARGs 是抗生素抗性組的主體。

優(yōu)勢(shì) ARGs 的判斷標(biāo)準(zhǔn)為其在一個(gè)樣本組中的平均相對(duì)豐度在該樣本組所有 ARGs 平均相對(duì)豐度總和中的占比大于等于 1%。春季水體樣本組有 10類優(yōu)勢(shì) ARGs, 占比從大到小排序?yàn)闂U菌肽類(bacit-racin, 相對(duì)豐度為 5.44×10?2~1.01×10?1ratio, 平均相對(duì)豐度占比為 47.52%, 下同)、-內(nèi)酰胺類(beta-lactam, 2.36×10?3~2.26×10?1ratio, 28.85%)、甲氧芐氨嘧啶類(trimethoprim, 1.31×10?2~1.96×10?2ratio, 9.37%)、MLS 類(大環(huán)內(nèi)酯–林可胺–鏈霉殺陽菌素類, macrolide-lincosamide-streptogramin, 1.19×10?3~ 1.95×10?2ratio, 3.13%)、氨基糖苷類(aminoglycoside, 3.79×10?4~1.32×10?2ratio, 2.36%)、四環(huán)素類(tetra-cycline, 2.41×10?4~1.39×10?2ratio, 1.74%)、磺胺類(sulfonamide, 1.04×10?3~6.42×10?3ratio, 1.68%)、多粘菌素類(polymyxin, 1.81×10?3~3.94×10?3ratio, 1.54%)、多重耐藥類(multidrug, 3.8×10?4~4.9×10?3ratio, 1.28%)和莫匹羅星類(mupirocin, 1.35×10?3~ 3.78×10?3ratio, 1.19%) ARGs。

秋季水體樣本組有 9 類優(yōu)勢(shì) ARGs, 占比從大到小排序?yàn)? 桿菌肽類(5.21×10?2~9.25×10?2ratio, 74.16%)、β-內(nèi)酰胺類(2.98×10?4~2.06×10?2ratio, 6.66%)、多重耐藥性(1.16×10?3~6.98×10?3ratio, 4.05%)、氨基糖苷類(4.63×10?4~8.09×10?3ratio, 3.3%)、MLS類(1.53×10?4~7.14×10?3ratio, 3.06%)、磺胺類(9.72×10?4~4.91×10?3ratio, 2.93%)、甲氧芐氨嘧啶類(3.68×10?4~2.94×10?3ratio, 1.44%)、莫匹羅星類(5.61×10?4~1.73×10?3ratio, 1.34%)和四環(huán)素類(6.43×10?5~2.36×10?3ratio, 1.07%) ARGs。排除多粘菌素類 ARGs, 春、秋季兩個(gè)水體樣本組的共有優(yōu)勢(shì) ARGs 有 9 類, 分別占各自 ARGs 平均相對(duì)豐度總和的 97.12%和98.01%, 說明這 9 類優(yōu)勢(shì) ARGs是水體 ARGs的主要組成部分。

2.2 ARGs 的沿程變化

每個(gè)采樣點(diǎn)的 ARGs 相對(duì)豐度占比如圖 3 所示。春、秋季兩個(gè)水體樣本組占主導(dǎo)地位的 3 類ARGs 分別是桿菌肽類、甲氧芐氨嘧啶類和-內(nèi)酰胺類 ARGs (春季水體)以及桿菌肽類、-內(nèi)酰胺類和多重耐藥類 ARGs (秋季水體)。兩個(gè)樣本組之間具有季節(jié)差異, 秋季水體中桿菌肽類 ARGs 占絕對(duì)主導(dǎo)地位(60.18%~89.43%), 高于其在春季水體中的占比(26.35%~72.31%); 秋季水體中多重耐藥類ARGs 占比(1.83%~7.83%)高于其在春季水體中的占比(0.11%~2.62%); 甲氧芐氨嘧啶類 ARGs 在秋季水體中的占比較低(0.58%~2.32%), 在春季水體中則具有一定的占比(4.81%~15.83%)。此外, 春季水體樣本組 TC 和 DJK 采樣點(diǎn)中-內(nèi)酰胺類 ARGs 的占比分別為 66.74%和 17.99%, 明顯高于其在該樣本組的其他采樣點(diǎn)(2.1%~11.53%)和秋季水體樣本組中(0.47%~14.36%)的占比。

影響環(huán)境中 ARGs 相對(duì)豐度與組成的因素較多, 大量使用的抗生素對(duì)環(huán)境微生物的選擇作用導(dǎo)致具有抗生素抗性的微生物產(chǎn)生和快速傳播[37–38]。Forsberg 等[39]發(fā)現(xiàn), 細(xì)菌群落組成是土壤 ARGs 組成的最主要決定因素, 說明環(huán)境微生物群落對(duì)ARGs 的組成結(jié)構(gòu)有重要影響。溫度和營養(yǎng)鹽等各種環(huán)境因子會(huì)影響微生物生長, 從而改變微生物的群落結(jié)構(gòu)[40–41], 間接地影響 ARGs 的組成。此外, 污水處理廠是重要的 ARGs 匯集與傳播場(chǎng)所[42], 其出水排放會(huì)影響受納水體中 ARGs 與細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)[43]。

在春季和秋季水體中, 桿菌肽類 ARGs 占比基本上是最高的。桿菌肽是一種在臨床上用于對(duì)抗皮膚感染的廣譜抗生素[44]。Li 等[34]發(fā)現(xiàn), 桿菌肽類ARGs 是珠三角河水和人類糞便中最主要 ARGs 之一, 與桿菌肽作為人類和動(dòng)物藥物的大量使用有關(guān)。Christgen 等[45]通過對(duì)英格蘭北部市政污水處理廠出水的檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)多重耐藥類、桿菌肽類和四環(huán)素類 ARGs 是出水中 ARGs 的主要部分, 分別占29.4%, 13%和 16.8%。此外, Jia等[46]通過高通量測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)多重耐藥類、桿菌肽類和磺胺類 ARGs 是南京地區(qū)飲用水中最主要的 3 類 ARGs。因此, 桿菌肽類 ARGs 廣泛分布于各種環(huán)境中, 是抗生素抗性組的重要組成部分之一。

由圖 3 還發(fā)現(xiàn), 與春季相比, 秋季不同采樣點(diǎn)ARGs 的組成更加穩(wěn)定。可能的原因是, 秋季雨水多, 河流水位高于春季, 水體的混合作用比較明顯, 導(dǎo)致沿程 ARGs 的組成變化不大; 春季雨水較少, 不同采樣點(diǎn)附近人類活動(dòng)和污水排放對(duì) ARGs 的組成結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度影響較大。Knapp 等[47]對(duì)古巴哈瓦那 Almendares 河流的研究也發(fā)現(xiàn), 旱季水體中ARGs 的空間變化比雨季更明顯, 河道附近的廢水排放顯著地影響不同河段的 ARGs 豐度水平。

在春季樣本組中, 位于丹江口水庫上游的 BH以及下游的 XY, XT 和 JJZ 采樣點(diǎn)的 ARGs 組成結(jié)構(gòu)較為相似, 而位于水庫內(nèi)的 TC 及丹江口大壩下的DJK 采樣點(diǎn)中-內(nèi)酰胺類占比明顯高于其他采樣點(diǎn)。BH, XY, XT 和 JJZ 采樣點(diǎn)均位于人口稠密的地區(qū), 人類對(duì) ARGs 組成的影響較大, 而 TC 采樣點(diǎn)所處的庫區(qū)周圍人類活動(dòng)影響很小, 可能導(dǎo)致 ARGs的組成結(jié)構(gòu)與其他采樣點(diǎn)不同。Zhang 等[48]通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 2013 年-內(nèi)酰胺類是中國第二大使用量的抗生素。2016—2017 年對(duì)丹江口水庫的抗生素檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)-內(nèi)酰胺類是主要抗生素種類之一, 抗生素總濃度在春季最高, 可能的原因是其在低流量和較冷的溫度條件下, 生物降解和光解速率均較慢[49]。這些因素都可能導(dǎo)致春季水體樣本組中 TC 采樣點(diǎn)的-內(nèi)酰胺類 ARGs 占比遠(yuǎn)高于同組其他采樣點(diǎn)和秋季樣本組。又因?yàn)?DJK 采樣點(diǎn)位于丹江口大壩下, 受水庫放水影響, 故春季水體樣本組中該采樣點(diǎn)的-內(nèi)酰胺類 ARGs 占比也較大。

2.3 ARGs的季節(jié)差異性

為了驗(yàn)證 ARGs 的季節(jié)差異性, 對(duì)春、秋季水體樣本組的 ARGs 相對(duì)豐度做 NMDS 和 ANOSIM分析。如圖 4(a)所示, 春季和秋季水體的樣本點(diǎn)聚為兩簇, 說明分組效果較好。秋季水體的 6 個(gè)樣本點(diǎn)均相對(duì)緊密地聚集在一起, 春季水體的 BH, XY, XT 和 JJZ 樣本點(diǎn)聚集在一起, 而 TC 和 DJK 樣本點(diǎn)與同組其他 4 個(gè)樣本點(diǎn)的距離較遠(yuǎn), 可能的原因是這兩個(gè)樣本點(diǎn)的 ARGs 組成結(jié)構(gòu)與其他樣本點(diǎn)差異較大。ANOSIM 分析進(jìn)一步驗(yàn)證了 NMDS 分析的結(jié)果。如圖 4(b)所示, 春季與秋季水體樣本組之間具有較為顯著的差異性(=0.267,=0.042), 組間相異指數(shù)(dissimilarity ranks)為 3~66, 相異指數(shù)中位數(shù)為 38; 春季水體組內(nèi)相異指數(shù)為 1~62, 相異指數(shù)中位數(shù)為40; 秋季水體組內(nèi)相異指數(shù)為 2~50, 相異指數(shù)中位數(shù)為 16。可以發(fā)現(xiàn), 秋季水體組內(nèi)的差異較小, 而因庫區(qū)內(nèi) TC 采樣點(diǎn)和丹江口大壩下DJK 采樣點(diǎn)的 ARGs 組成與組內(nèi)其他采樣點(diǎn)不同, 春季水體組內(nèi)具有一定的差異, 不過從整體上看, 春季與秋季水體樣本組還是具有顯著差異。

使用 STAMP 軟件進(jìn)一步分析兩個(gè)水體樣本組ARGs 種類的組間差異, 結(jié)果如圖 5 所示, 發(fā)現(xiàn)甲氧芐氨嘧啶類、多粘菌素類和多重耐藥類 ARGs 在組間具有顯著差異(<0.05)。甲氧芐氨嘧啶類和多粘菌素類 ARGs 在春季水體組的平均相對(duì)豐度占比分別為9.37%和 1.54%, 大于其在秋季水體組的 1.44%和 0.57%; 多重耐藥類 ARGs 在秋季水體組中的平均相對(duì)豐度占比則大于春季水體組, 分別為 4.05%和1.28%。這一結(jié)果與圖 3 相符。圖 3 中, 甲氧芐氨嘧啶類和多粘菌素類 ARGs 在春季水體組中每個(gè)采樣點(diǎn)的相對(duì)豐度占比都高于秋季水體組中的對(duì)應(yīng)采樣點(diǎn), 而多重耐藥類 ARGs 在春季水體組中所有采樣點(diǎn)的相對(duì)豐度占比低于秋季水體組中對(duì)應(yīng)的采樣點(diǎn)。因此, 兩個(gè)樣本組間的 ARGs 組成存在顯著的季節(jié)差異。

2.4 ARGs之間的相關(guān)性

不同種類的 ARGs 會(huì)被相同的微生物攜帶, 從而具有共存關(guān)系[50]。有研究表明多種 ARGs 廣泛共存于大量病原體中, 并可以在土壤細(xì)菌和病原體間進(jìn)行交換[51]。這些共存的 ARGs 被環(huán)境微生物, 尤其是致病菌攜帶后, 對(duì)人體健康的威脅遠(yuǎn)高于單種ARGs 的威脅, 因此有必要對(duì)水源區(qū)共存的 ARGs種類進(jìn)行研究。

使用 SPSS 18.0 軟件對(duì)所有 ARGs 相對(duì)豐度進(jìn)行 Spearman 相關(guān)性分析, 去除重復(fù)值、無顯著性以及有顯著性但相關(guān)系數(shù)小于 0.7的記錄, 結(jié)果如表 1所示?？梢园l(fā)現(xiàn), 相關(guān)系數(shù)大于 0.7 的 ARGs 組合共有 23 對(duì), 其中值在 0.01~0.05之間的有 1 對(duì), 在0.001~0.01 之間的有 14 對(duì), 小于等于 0.001 的有 8對(duì)。這 23 對(duì) ARGs 組合均具有顯著的相關(guān)關(guān)系, 涵蓋 13 種 ARGs。相關(guān)系數(shù)大于等于 0.9 的有 3 對(duì), 分別是喹諾酮類與氯霉素類 ARGs、磺胺類與氨基糖苷類 ARGs、四環(huán)素類與氨基糖苷類 ARGs, 相關(guān)系數(shù)分別為 0.922, 0.902和 0.958,值均小于等于0.001。這種顯著的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系說明 3 對(duì)組合中的ARGs 極有可能分別共存于一種微生物中。

在表 1 中還可以發(fā)現(xiàn), 與最多種 ARGs 具有顯著較強(qiáng)相關(guān)關(guān)系的是四環(huán)素類和氨基糖苷類 ARGs, 分別形成 7 種和 6 種組合。Li 等[34]對(duì)水體、土壤、沉積物和生物膜樣本中的 ARGs 進(jìn)行 network 共存網(wǎng)絡(luò)分析, 發(fā)現(xiàn)屬于四環(huán)素類 ARGs 的以及氨基糖苷類抗性蛋白在共存網(wǎng)絡(luò)圖中與最多的 ARGs相連, 是圖中的兩個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn), 可能的原因是它們都被環(huán)境中廣泛存在的特定微生物所攜帶; 此外, 這兩種 ARGs 及與其共存的 ARGs 相對(duì)豐度之間具有變化的一致性, 用冪函數(shù)對(duì)兩種相對(duì)豐度的擬合性較好(2=0.86~0.92), 因此可用來預(yù)測(cè)共存的ARGs 相對(duì)豐度。本研究結(jié)果與 Li 等[34]的結(jié)果相似, 因此四環(huán)素類和氨基糖苷類這兩種 ARGs 可以作為預(yù)測(cè)環(huán)境中與其共存 ARGs 相對(duì)豐度的指示種類, 在反映飲用水源區(qū)的 ARGs 污染程度時(shí)可以發(fā)揮一定的作用。

表1 ARGs相對(duì)豐度Spearman相關(guān)性分析

說明: 重復(fù)值、無顯著性關(guān)系值以及顯著相關(guān)系數(shù)小于0.7的值未列出; *=0.01~0.05, **=0.001~0.01, ***≤0.001。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)南水北調(diào)中線工程水源區(qū) ARGs 的多樣性、相對(duì)豐度以及 ARGs 之間的相關(guān)性等方面進(jìn)行分析, 得到如下結(jié)論。

1)在丹江口水庫和漢江水源區(qū)春季和秋季水體中分別檢測(cè)到 21 類和 19 類 ARGs, 其中共有的 9類優(yōu)勢(shì) ARGs 相對(duì)豐度占 97%以上, 是水體 ARGs的主要組成部分。

2)桿菌肽類 ARGs 是水源區(qū)最主要的 ARGs, 而春季丹江口水庫陶岔采樣點(diǎn)的-內(nèi)酰胺類 ARGs占比最高。沿程 ARGs 組成結(jié)構(gòu)的差異秋季比春季小, 可能與春季雨水量少以及沿岸人類活動(dòng)影響有關(guān)。

3)水體中 ARGs 存在顯著的春、秋季節(jié)差異, 甲氧芐氨嘧啶類、多粘菌素類和多重耐藥類是具有顯著季節(jié)差異的 ARGs 種類。

4)具有顯著較強(qiáng)相關(guān)關(guān)系的有 13 類 ARGs, 可分為 23 對(duì)組合, 其中 3 對(duì)組合的相關(guān)性最強(qiáng), 構(gòu)成組合的 ARGs 很可能分別共存于一種微生物中。四環(huán)素類和氨基糖苷類 ARGs 可能作為預(yù)測(cè)水源區(qū)環(huán)境中與其共存 ARGs 相對(duì)豐度的指示種類。

本研究得到的水源區(qū)內(nèi)主導(dǎo) ARGs 種類和ARGs 組成的顯著春秋季節(jié)差異以及可能作為指示種類的 ARGs 等結(jié)果, 有助于了解水源區(qū) ARGs 的污染現(xiàn)狀, 也可為飲用水源區(qū)的水質(zhì)保護(hù)和 ARGs污染的針對(duì)性防治與管理提供借鑒意義。

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Diversity of Antibiotic Resistance Genes in Water Source Areas of the Middle Route of the South-to-North Water Transfer Project

PAN Rui, LIU Shufeng, WANG Jiawen, NI Jinren?

Department of Environmental Engineering, Peking University, Beijing 100871; ? Corresponding author, E-mail: nijinren@iee.pku.edu.cn

In order to study the pollution status and regularity of antibiotic resistance genes (ARGs), high-throughput sequencing methods were used to analyze the diversity of ARGs along Danjiangkou Reservoir and Hanjiang River in spring and autumn of 2014. 21 and 19 types of ARGs were detected in spring and autumn samples respectively. Among them, 9 types of ARGs were the main types of ARGs content. Bacitracin was the most important ARGs in water, while-lactam accounted for the highest proportion in the Taocha sampling sites of Danjiangkou Reservoir. The composition difference of ARGs among sampling sites in Water_Autumn samples was smaller than that in spring. NMDS and ANOSIM analysis showed significant seasonal differences in the composition of ARGs. Trimethoprim, polymyxin and multidrug were ARGs which had significant seasonal differences. Correlation analysis found 13 types of ARGs with significantly strong correlations with each other, and the most relevant ARGs were likely to coexist in the same microorganism. In addition, tetracycline and aminoglycoside may be useful as indicators for predicting the relative abundance of ARGs coexisting in the water source region. This study could provide reference for water quality protection and ARGs pollution prevention and management in drinking water source areas.

drinking water source; antibiotic resistance genes; seasonal differences; correlation of ARGs

10.13209/j.0479-8023.2020.024

國家自然科學(xué)基金(51539001)資助

2019–04–15;

2019–06–28