鐘雷響，徐少華

(深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 深圳 518000)

硝基咪唑類藥物是一種抗菌藥物，在預(yù)防和治療家禽的組織滴蟲病和寄生蟲病、牛滴蟲病、豬出血性腸炎、魚寄生蟲感染和蜂微孢子蟲病等疾病上有很大的作用。此類藥物進(jìn)入動(dòng)物易感的細(xì)胞后，在無(wú)氧或少氧環(huán)境和較低的氧化還原電位下，其硝基會(huì)被電子專遞蛋白還原成具有細(xì)胞毒性作用的氨基，抑制微生物細(xì)胞合成DNA，并降解DNA，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)或阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡，發(fā)揮其迅速殺滅厭氧菌和有效控制細(xì)菌感染的作用[1]。體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)，硝基咪唑類藥物有遺傳毒性、致畸和可疑致癌的作用[2-3]。為了防止甲硝唑殘留傷害人類健康，不少國(guó)家都制定了相關(guān)規(guī)定，歐盟和加拿大等地區(qū)或國(guó)家都禁止在食源性動(dòng)物生產(chǎn)中使用甲硝唑。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2002年頒布的227號(hào)公告《杜絕禁用獸藥的濫用》中規(guī)定不準(zhǔn)以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在食品動(dòng)物的生產(chǎn)中使用甲硝唑及其鹽和酯。本試驗(yàn)選取烏雞為試驗(yàn)動(dòng)物，一方面因?yàn)闉蹼u是廣東省傳統(tǒng)的地方名菜烏雞煲湯的主材，消費(fèi)量大；另一方面由于烏雞自身的藥物代謝困難，容易造成藥物在體內(nèi)殘留蓄積。為了保證消費(fèi)者能在市場(chǎng)上購(gòu)買到安全的烏雞，準(zhǔn)確測(cè)定烏雞肉產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物的含量十分重要。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(Electrospray Ionization，ESI)；Oasis?PRIME HLB(6 cc 200 mg)固相萃取小柱(美國(guó)Waters公司)、0.22 μm有機(jī)相濾膜(上海安譜公司)、電子天平(感量0.01 g、感量0.000 1 g，瑞士梅特勒公司)；高速離心機(jī)(美國(guó)sigma公司)；固相萃取裝置；超聲波清洗儀；可控溫氮吹濃縮儀；渦旋振蕩器。

1.2 試劑

甲硝唑和羥基甲硝唑(MNZOH)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥99%，美國(guó)DR公司)，水符合GB/T 6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)；甲醇(CH3OH)、乙腈(CH3CN)和甲酸(HCOOH)均為色譜純。

1.3 試劑配制

乙腈水溶液由90%乙腈和10%水配制而成，甲醇水溶液由10%甲醇水和0.1%甲酸配制而成。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均用甲醇配制成1.00 mg/mL，在-18 ℃條件下于棕色瓶中保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)藥物的靈敏度和儀器線性范圍，用甲醇水溶液配成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 烏雞

烏雞購(gòu)自廣東省深圳市各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和商場(chǎng)超市。試驗(yàn)用的雞肉樣品取自烏雞胸部和腿部的肌肉，經(jīng)碾磨機(jī)粉碎至均勻肉泥狀，裝瓶保存于-18 ℃。

2 試驗(yàn)方法

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件

(a)色譜柱：亞乙基橋雜化顆粒(BEH)C18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)；(b)流速：0.3 mL/min；(c)柱溫：40 ℃；(d)進(jìn)樣量：5.0 μL；(e)流動(dòng)相及梯度洗脫程序見表1。

2.1.2 質(zhì)譜參考條件

(a)離子源：電噴霧離子源(ESI)；(b)掃描方式：正離子掃描/負(fù)離子掃描；(c)檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(Multi Reaction Monitoring Mode，MRM)；(d) 電噴霧電壓(IS)：5 500 V/-4 500 V；(e)離子源溫度(TEM)：550 ℃；(f)氣簾氣(CUR)：35 psi；(g)碰撞氣壓力(CAD)：8 psi；(h)噴霧氣(GS1)：55 psi；(i)輔助加熱氣(GS2)：55 psi；(j)藥物保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及去簇電壓和碰撞電壓見表2。

2.2 前處理步驟

早期研究將樣品的pH調(diào)節(jié)為3，用蛋白酶過(guò)夜酶解提取與組織蛋白結(jié)合的殘留物[4]，但近期研究表明沒(méi)必要進(jìn)行酶解[5-6]。因此，本試驗(yàn)用90%的乙腈水溶液作為提取劑，直接提取殘留藥物。

2.2.1 提取

稱取試樣2 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管內(nèi)，加乙腈水溶液5 mL，震蕩搖勻30 s，于超聲波清洗儀超聲5 min，用高速離心機(jī)以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于15 mL離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液。上清液混勻之后再次用高速離心機(jī)以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。

2.2.2 凈化

于上述離心后提取液中移取5 mL上清液，直接過(guò)固相萃取柱，保持1 s/滴的速度。用玻璃小管收集全部流出液，準(zhǔn)確移出2 mL到15 mL帶刻度的小管內(nèi)。流出液在40 ℃水浴下氮?dú)獯抵辽儆?.5 mL。殘留液用甲醇水溶液定容至1.00 mL，過(guò)0.22 μm水相濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 高效液相條件確定

為尋找分離度好、靈敏度高且峰形尖銳的液相條件，參考相關(guān)文獻(xiàn)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，選用ACQUITYUPLC BEH C18(1.7 μm，3.0 mm×100 mm)色譜柱，柱溫為40 ℃，采用甲酸水和甲醇作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣流速為0.30 ng/mL時(shí)，硝基咪唑相應(yīng)強(qiáng)度1.5×105，背景基線非常低，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，可有效進(jìn)行硝基咪唑的定性定量檢測(cè)(圖1和圖2)。

3.2 前處理方法的確定

由于雞的肌肉呈現(xiàn)纖維狀，所以需要用本方法先對(duì)肌肉進(jìn)行粉碎處理。乙腈沉淀蛋白效果較好，與水性基質(zhì)互溶，是提取組織中硝基咪唑類藥物的常用溶劑之一。乙腈用于提取禽肉類樣品，回收率在79%～93%[7-8]，故本試驗(yàn)選用乙腈水溶液作為提取劑。樣品加入提取劑后經(jīng)過(guò)超聲輔助提取，可以更充分提取烏雞肌肉中的硝基咪唑類藥物。再經(jīng)過(guò)高速離心，使提取劑中的殘?jiān)恋?，其中試劑也起到了稀釋的作用，有利于降低其他成分?duì)檢測(cè)儀器的信號(hào)干擾，并且可提高儀器檢測(cè)的靈敏度。

3.3 線性范圍，檢出限檢測(cè)結(jié)果

按照方法條件設(shè)置參數(shù)，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液(0.10 μg/L、2.00 μg/L、20.0 μg/L、100 μg/L 和500 μg/L)，待儀器穩(wěn)定后，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲硝唑相關(guān)系數(shù)為r＝0.997，羥基甲硝唑相關(guān)系數(shù)為r＝0.999 3。

以烏雞肌肉樣品為基質(zhì)，添加濃度為1.0 μg/kg，按照上述方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，平行樣品(n)為7個(gè)，對(duì)于甲硝唑，根據(jù)各樣品檢測(cè)值 (0.80 μg/kg、0.88 μg/kg、1.06 μg/kg、0.84 μg/kg、0.88 μg/kg、0.80 μg/kg和1.02 μg/kg)計(jì)算出平均值()(0.897 μg/kg)及標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sb)(0.103 6)，當(dāng)被分析物的回收率在70%～120%時(shí)，可計(jì)算檢出限為0.35 μg/kg；對(duì)于羥基甲硝唑，根據(jù)各樣品檢測(cè)值(0.88 μg/kg、0.84 μg/kg、0.74 μg/kg、0.74 μg/kg、0.88 μg/kg、0.88 μg/kg和1.06 μg/kg)計(jì)算出平均值()(0.860 μg/kg)及標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sb)(0.108 4)，當(dāng)被分析物的回收率介于70%～120%時(shí)，可計(jì)算檢出限為0.38 μg/kg。計(jì)算公式如下：

檢出限(MDL)=(k×Sb×C)/

式中：k為置信因子，取3。

3.4 方法精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果

以烏雞肌肉樣品為基質(zhì)，進(jìn)行六組平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測(cè)試，甲硝唑加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為80%～106%、90%～109%和91.2～96.6%，羥基甲硝唑加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為74%～88%、78%～93%和86.0～96.6%。甲硝唑及硝基甲硝唑的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

4 討論

本試驗(yàn)討論建立了測(cè)定烏雞肌肉中硝基咪唑類藥物含量的高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法通過(guò)乙腈水溶液提取、離心和氮吹等處理步驟，最終建立了甲硝唑和羥基甲硝唑的方法檢出限 分別達(dá)到 了 0.35 μg/kg和 0.38 μg/kg， 線性范圍為0.1 μg/L～500 μg/L。烏雞肌肉樣品在1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10.0 μg/kg三個(gè)水平添加回收試驗(yàn)條件下，甲硝唑回收率為80%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.45%～11.00%；羥基甲硝唑回收率為74.0%～96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.96%～8.33%。該方法具有分析過(guò)程簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確精密和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能滿足烏雞肌肉中硝基咪唑類藥物的快速篩查和檢測(cè)定量。

參考文獻(xiàn)：(8篇，略)