邢作志，張 雁

(1 甘州區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 張掖 734000；2 張掖市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊，甘肅 張掖 734000)

小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起山羊和綿羊的一種急性接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。本病以發(fā)病率高和死亡率高為特點，嚴重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。本次試驗主要應(yīng)用競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA三種免疫抗體檢測方法檢測小反芻獸疫病毒的免疫抗體，以此評價小反芻獸疫疫苗的免疫效果。

1 試驗材料

1.1 檢測樣品

血清樣品采集自甘州區(qū)轄區(qū)內(nèi)經(jīng)小反芻獸疫活疫苗免疫的羊，要求清亮且無溶血。

1.2 試驗器材

RT-6100酶標儀、37 ℃恒溫箱、500 mL量筒、純水儀、5 μL～50 μL單道移液器、10 μL～100 μL多道移液器、50 μL～300 μL多道移液器、配套移液槍頭、加液槽和96孔抗原抗體反應(yīng)板均為試驗常用儀器，小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒、間接ELISA抗體檢測試劑盒和阻斷ELISA抗體檢測試劑盒分別購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、深圳真瑞生物科技有限公司和青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心。

2 試驗方法

2.1 競爭ELISA抗體檢測

2.1.1 加樣

依次加入以下試劑及樣品：① 待檢血清，每份血清必須做兩個重復(fù)孔，每孔加入待檢血清樣品50 μL；②對照，每塊酶標板上均應(yīng)設(shè)標準陰性血清、陽性血清、單克隆抗體及空白對照孔，其中標準陰性血清應(yīng)設(shè)2孔，標準陽性血清應(yīng)設(shè)2孔，每孔加入相應(yīng)血清50 μL，空白對照設(shè)2孔，每孔加入100 μL血清稀釋液，單克隆抗體對照設(shè)4孔，每孔加入50 μL血清稀釋液；③加單抗，將單克隆抗體用血清稀釋液進行1∶100倍稀釋，除空白對照孔外其他各孔每孔加50 μL稀釋后的單克隆抗體。

小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測樣品布板情況見圖1。

2.1.2 孵育

完成加樣后，將酶標板置于微量振蕩器上振蕩混勻，隨后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

2.1.3 洗酶標板加酶結(jié)合物

取出酶標板甩干，用洗滌液(1×PBST)洗滌3次，在吸水紙上拍干，用血清稀釋液按1∶100稀釋兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

2.1.4 洗酶標板加底物溶液

取出酶標板甩干，用洗滌液(1×PBST)洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，置37 ℃避光靜置顯色反應(yīng) 10 min～ 15 min。

2.1.5 加終止液并讀數(shù)

顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，在酶標儀上讀取OD450nm值。

2.1.6 結(jié)果判定

根據(jù)公式：PI＝[1-(樣品孔的OD450nm值/單抗對照孔OD450nm值)]×100%進行判定。

判定標準：① 當陰性對照孔PI＜40%，陽性對照孔PI＞60%時檢測結(jié)果成立，否則該次檢測結(jié)果無效；②樣品血清PI≥45%，抗體陽性，PI＜40%，抗體陰性，40%≤PI＜45%，則判定為可疑。

2.2 間接ELISA抗體檢測

小反芻獸疫間接ELISA抗體檢測樣品布板情況見圖2。

⑴ 血清稀釋：在血清稀釋板中按1∶100的體積比稀釋待檢血清，每個樣品在加入包被板前應(yīng)充分混勻。

⑵ 將稀釋好的待檢血清加入包被好的酶標板中，每孔100 μL，同時設(shè)陰性對照1孔和陽性對照2孔，每孔加入相應(yīng)的血清100 μL，蓋上封板膜，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶標板甩干，用工作濃度洗滌液洗滌4～6次，在吸水紙上拍干，每孔加入50 μL酶結(jié)合物，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑷ 取出酶標板甩干，用工作濃度洗滌液洗滌4～6次，在吸水紙上拍干，每孔加入100 μL顯色液，置37 ℃避光靜置顯色反應(yīng)10 min。

⑸ 顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)，在酶標儀上讀取OD450nm值。

⑹ 結(jié)果判定：陰性對照的OD450nm值＜0.2，陽性對照的OD450nm值＞0.4時試驗成立；樣品OD450nm值/陽性對照的OD450nm均值＝S/P值，S/P值 ≥ 0.3判為陽性，S/P值＜0.3判為陰性。

2.3 阻斷ELISA抗體檢測

小反芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測樣品布板情況見圖3。

⑴ 在陰性對照孔和陽性對照孔中加入相應(yīng)的血清，每孔50 μL，在酶標單抗對照孔中加入50 μL稀釋液。在每個樣品孔中加入25 μL稀釋液，再加入25 μL待檢血清，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

⑵ 取出酶標板甩干，用洗滌液(用超純水做20倍稀釋，按5‰比例加入吐溫-20)(1×)洗滌4次，在吸水紙上拍干，用血清稀釋液按5倍稀釋酶標單抗，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶標板甩干，用洗滌液(1×)洗滌4次，在吸水紙上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，室溫避光靜置顯色反應(yīng)10 min～ 15 min。

⑷ 顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。在酶標儀上讀取OD450nm值，計算阻斷率。阻斷率(PB)計算方法：PB＝100-[待檢血清OD450nm值(或?qū)φ誒D450nm平均值)]×100%/Cm的 OD450nm平均值。

⑸ 對結(jié)果進行判定。陽性對照的阻斷率(PB)＞60，陰性對照的阻斷率(PB)＜40，試驗結(jié)果有效；待檢樣品阻斷率(PB)＞50判為陽性，待檢樣品阻斷率(PB)≤50判為陰性。

3 結(jié)果與討論

⑴ 競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA三種免疫抗體檢測方法都可對小反芻獸疫病毒免疫抗體進行檢測，在同一塊96孔酶標板中，競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA可以分別檢測43份、93份和90份樣品，但是競爭ELISA和間接ELISA的操作相對比較復(fù)雜，且用時較多；阻斷ELISA的操作簡單，用時少。如果同時檢測100份樣品，競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA的準確率分別為85%、88%和95%，因此阻斷ELISA的準確度和重復(fù)性均高于其他兩種檢測方法，是小反芻獸疫病毒免疫抗體檢測的首選檢測方法。

⑵ 小反芻獸疫對反芻動物的危害大，發(fā)病率和病死率通常分別超過60%和50%，該病最有效的防控手段是給動物接種小反芻獸疫疫苗，因此，小反芻獸疫病毒免疫抗體是評價羊場安全及經(jīng)濟效益的最理想的指標，選擇正確的抗體檢測方法也是重中之重。