基于葉綠體rbcL序列擴(kuò)增的天南星藥材及其常見混偽品的分子鑒定研究

許貞 劉春生 胡小松 隋丞琳 崔秀梅 侯鳳祥 顧選

藥材天南星為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.)Schott、異葉天南星ArisaemaheterophyllumBl.或東北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥塊莖，性溫，味苦辛，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有散結(jié)消腫的功效[1]。天南星藥材通常被加工成制天南星或膽南星飲片，具有化痰、息風(fēng)止痙等功效，常用于頑痰咳嗽、風(fēng)痰眩暈、中風(fēng)痰壅、口眼斜等癥[2]，臨床需求量大。此外，天南星入藥能夠起到祛痰、抗炎以及散結(jié)消腫的作用，所以其常用于抗腫瘤藥物組方之中。有研究表明，鮮天南星水提取物可對(duì)小鼠子宮纖維瘤起到一定的抑制作用[3]，且不同來源的天南星外用對(duì)大鼠外傷性血瘀有很好的治療作用[4]。由于天南星科植物眾多，全國各地用藥習(xí)慣不同，往往就地取材入藥，本草記載也存在同名異物，同物異名等情況，導(dǎo)致中藥材天南星的市場基原混亂，很難辨別。市場上，天南星主流基原為天南星A.erubescens，除正品天南星外，常有天南星科其他種類如半夏屬掌葉半夏Pinelliapedatisecta、半夏Pinelliaternata、菖蒲屬菖蒲Acoruscalamus、千年健屬千年健Homalomenaocculta等充作天南星用或混淆使用。天南星科植物多有毒，毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)對(duì)口腔、咽喉及皮膚黏膜有很強(qiáng)的刺激性[5]，且不同物種毒性強(qiáng)度不同。吳紫君等[6]研究結(jié)果表明，天南星科3種有毒中藥天南星、半夏、白附子生品均有明顯的急性毒性，其中以生半夏毒性最強(qiáng)。因此，正品天南星的正本清源和準(zhǔn)確鑒定對(duì)于用藥安全顯得十分重要。

目前，天南星真?zhèn)舞b別的方法除性狀[7]外，還有薄層鑒別法[8]、指紋圖譜鑒別法[9-10]、近紅外光學(xué)鑒別[11-12]等方法。雖然傳統(tǒng)的鑒別方法能夠?qū)μ炷闲沁M(jìn)行鑒別，但鑒別方法復(fù)雜，適用范圍較窄，且結(jié)果易受到產(chǎn)地、采摘時(shí)間、儲(chǔ)存條件等因素的影響，具有一定的局限性。而傳統(tǒng)性狀鑒別需要極大的工作經(jīng)驗(yàn)積累，無法快速普及。因此，為保證中藥材臨床用藥的安全、有效性，亟需建立一種穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的鑒別方法。自2003年首次提出“DNA條形碼”這一概念，DNA條形碼分子鑒定技術(shù)飛速發(fā)展，為傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)帶來了新的發(fā)展機(jī)遇[13-14]。DNA條形碼技術(shù)作為一種新興的鑒定技術(shù)，可用于中藥材的基原鑒定，并且具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。陳士林等[15]基于大樣本量實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建了中藥材DNA條形碼分子鑒定體系，并提出中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則。目前該指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國藥典》(2015版)。近年來DNA條形碼技術(shù)在中藥真?zhèn)舞b別中應(yīng)用越來越廣[16-17]。

本研究收集市場天南星正品及其常見混偽品，運(yùn)用分子鑒定技術(shù)，采用葉綠體核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶大亞基(Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase large subunit，rbcL)基因序列引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、測序，結(jié)合Genbank數(shù)據(jù)庫，通過計(jì)算種內(nèi)、種間K2-P遺傳距離及構(gòu)建N-J樹對(duì)不同樣品進(jìn)行鑒定，旨在對(duì)天南星藥材及其常見混偽品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，為市場上的天南星藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和用藥準(zhǔn)確提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

MM400冷凍混合球磨儀(德國RETSCH公司)，各種量程的微量移液器(德國 Eppendorf 公司)，高速離心機(jī)(德國Sigma公司)，BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR儀(德國Biomerta公司)，Bio-Rad型電泳儀，JY-SPDT型水平電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，BG-gdsAUTD520凝膠成像分析系統(tǒng)。

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(TIANGEN)，2×Taq plus per mastermix(含染料)(北京博邁德發(fā)展有限公司)，瓊脂糖G-10(賽百盛公司)。

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用試劑均為分析純。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)材料為植物塊莖，總計(jì)13份，均來源于北京華邈藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為天南星藥材及其常見混偽品，憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館，其余各基原物種rbcL序列均下載于GenBank核酸數(shù)據(jù)庫。材料來源及樣品信息見表1。

1.3 DNA提取

取樣品約20 mg，經(jīng)球磨儀粉碎后，根據(jù)天根廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒使用說明提取DNA，微量核酸定量儀檢測所得DNA質(zhì)量。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用30 μL反應(yīng)體系：樣品總DNA為2 μL，rbcL正反向引物(F-5′-ATGTCACCACAAACAGAAACT-3′；R-5′-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3′)各1 μL，2×Mix聚合酶15 μL，ddH2O補(bǔ)足。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3分鐘，30個(gè)循環(huán)：95℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，72℃總延伸5分鐘。

1.5 測序分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下檢驗(yàn)，在500 bp左右處出現(xiàn)單一、明亮、清晰的條帶，剩余PCR產(chǎn)物由北京小師弟商貿(mào)有限公司進(jìn)行測序分析。每個(gè)樣品均采用正反雙向測序，以保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 序列比對(duì)及N-J系統(tǒng)聚類樹建立

使用ContigExpress及DNAMAN軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接及序列比對(duì)，MEGA 5.0軟件對(duì)序列長度、變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)以及堿基組成進(jìn)行分析，計(jì)算種間種內(nèi)變異特點(diǎn)的最小種間距離、最大種內(nèi)距離并構(gòu)建N-J系統(tǒng)聚類樹，進(jìn)而評(píng)估該序列用于鑒別天南星及其混偽品的可靠性。

2 結(jié)果

本研究分析了天南星科4個(gè)屬8個(gè)種共21個(gè)樣本，其中除了13號(hào)樣品(Sample 13)未能擴(kuò)增成功外，其余樣品均獲得測序結(jié)果。經(jīng)過序列校正，對(duì)序列進(jìn)行分析。

表1 樣品信息表

2.1 rbcL序列分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品(Sample 1～13)及GenBank下載的天南星及其常見混偽品rbcL序列進(jìn)行分析，其中樣品編號(hào)Sample 1、Sample 6～12為天南星(A.erubescens)，樣品編號(hào)Sample 2為三裂葉半夏(P.tripartite)，樣品編號(hào)Sample 3～5為虎掌南星(P.pedatisecta)。樣品測序結(jié)果序列拼接后顯示，rbcL序列長度約為580 bp。對(duì)樣品的堿基組成進(jìn)行分析，不同種堿基組成如表2所示。樣本中G+C含量分布為43.6%～45.3%。G+C含量菖蒲(A.calamus)與其他7種差異較大，剩余7種G+C含量的整體差異較小，表明親緣關(guān)系可能較近，但是種間未重疊，說明種間存在明顯的遺傳變異。

表2 8種天南星科樣本rbcL序列堿基組成(%)

2.2 遺傳距離分析

使用MEGA5.0軟件基于K2-P模型計(jì)算各樣品種內(nèi)及種間遺傳距離。分析結(jié)果表明，樣本中最大種內(nèi)遺傳距離為0.2%，種間遺傳距離如表3所示。結(jié)果顯示種間遺傳距離變化范圍為0.3%～9.2%。其中，中藥天南星的正品來源天南星(A.erubescens)、異葉天南星(A.heterophyllum)、東北天南星(A.amurense)種間遺傳距離相對(duì)較小，顯示其親緣關(guān)系較近；天南星屬與菖蒲屬種間遺傳距離最大，顯示其二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 基于rbcL序列的天南星及其混偽品變異位點(diǎn)分析

結(jié)合測序結(jié)果，運(yùn)用DNAMAN分析軟件對(duì)GenBank下載序列與樣品序列的rbcL序列變異位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，除天南星(A.erubescens)種內(nèi)存在1處變異位點(diǎn)外，其余種內(nèi)均無變異位點(diǎn)，說明rbcL序列在同種內(nèi)具有較高的保守性?；趓bcL序列的種間變異位點(diǎn)如表4所示，結(jié)果顯示一共存在56處變異位點(diǎn)，其中菖蒲屬(Acoruscalamus)變異位點(diǎn)最多，其次為千年健屬千年健(Homalomenaocculta)，顯示其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而天南星屬與半夏屬變異位點(diǎn)較少，顯示其親緣關(guān)系較近。

表3 8種天南星科樣本種間遺傳距離

注： 編號(hào)1為天南星，編號(hào)2為異葉天南星，編號(hào)3為東北天南星，編號(hào)4為東臺(tái)南星，編號(hào)5為菖蒲，編號(hào)6為虎掌南星，編號(hào)7為三裂葉半夏，編號(hào)8為千年健。

2.4 基于rbcL序列的天南星及其混偽品N-J系統(tǒng)聚類樹構(gòu)建

測序結(jié)果經(jīng)過軟件處理后，使用MEGA 5.0軟件基于rbcL序列對(duì)天南星及其混偽品進(jìn)行系統(tǒng)聚類樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示，在天南星N-J系統(tǒng)聚類樹中發(fā)現(xiàn)，同種不同樣本嚴(yán)格聚為一支，且節(jié)點(diǎn)處支持率極高，證明天南星rbcL序列在種內(nèi)具有高度保守性。且天南星正品來源天南星(A.erubescens)、異葉天南星(A.heterophyllum)、東北天南星(A.amurense)親緣關(guān)系較近，與其他市場常見混偽品嚴(yán)格區(qū)別。顯示rbcL序列對(duì)正品天南星及其市場常見混偽品具有很好的鑒別能力。

3 討論

天南星科藥材種類繁多，植物分布廣泛[18-19]，植株及塊莖形態(tài)多有相似，難以辨別[20]，藥材性狀易混淆，故而導(dǎo)致市場上用藥比較混亂。且天南星科中藥多有毒[21]，毒性各有不同，因而品種不清導(dǎo)致的混用極可能造成用藥安全隱患。本實(shí)驗(yàn)采集市場天南星正品及其混偽品，旨在將其明確區(qū)分。

目前關(guān)于中藥材鑒定的方法多種多樣，但傳統(tǒng)性狀鑒別方法具有一定的局限性，遠(yuǎn)紅外、指紋圖譜等方法操作復(fù)雜。而近些年來發(fā)展較快的DNA分子鑒定技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定相結(jié)合的方法，可大大提高藥材鑒定的效率。且研究結(jié)果表明，分子鑒定技術(shù)能夠有效解決中藥材的真?zhèn)螁栴}，符合中藥材鑒定簡單、精確的特點(diǎn)，有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)中藥材及其基原物種的準(zhǔn)確鑒定。目前，已有多種基因片段被作為植物的通用條形碼而廣泛使用，如ITS 2、psbA-trnH、matK、rbcL等[22]。生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦將編碼rbcL和成熟酶K(Maturase K,matK)的基因作為陸生植物的DNA條形碼序列[23]。Newmaster 等發(fā)現(xiàn)rbcL能夠鑒別同屬85%左右的物種，認(rèn)為rbcL在植物類群中可作為DNA條形碼候選序列，具有較好的鑒定效率[24]。

表4 8種天南星科樣本變異位點(diǎn)分析

注： 編號(hào)1為天南星，編號(hào)2為異葉天南星，編號(hào)3為東北天南星，編號(hào)4為東臺(tái)南星，編號(hào)5為菖蒲，編號(hào)6為虎掌南星，編號(hào)7為三裂葉半夏，編號(hào)8為千年健。

注：編號(hào)1～3為天南星，編號(hào)4～6為異葉天南星，編號(hào)7～9為東北天南星，編號(hào)10～12為東臺(tái)南星，編號(hào)13～14為菖蒲，編號(hào)15～17為虎掌南星，編號(hào)18為三裂葉半夏，編號(hào)19～20為千年健。圖1 天南星及其市場常見

混偽品rbcL N-J樹(Bootstrap>1000)

目前，關(guān)于中藥天南星的DNA分子鑒定已有報(bào)道，劉利平等[25]考察了4個(gè)DNA條形碼(psbK-psbI，matK，rbcL，atpF-atpH)對(duì)天南星及其易混品的鑒定能力，結(jié)果表明atpF-atpH序列和psbK-psbI序列較為適用，rbcL的鑒定成功率僅為41.67%。

本實(shí)驗(yàn)中選擇了較為常用的3種DNA條形碼進(jìn)行擴(kuò)增比較，包括ITS、psbA-trnH和rbcL。由于收集的樣品來自市場，樣品表面難免存在真菌污染的情況，實(shí)驗(yàn)過程中在采取ITS通用序列擴(kuò)增測序時(shí)發(fā)現(xiàn)因真菌污染導(dǎo)致擴(kuò)增成功率不高，峰圖雜亂，甚至測出真菌序列，鑒定效率較低。在對(duì)rbcL序列與psbA-trnH序列使用通用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，psbA-trnH引物對(duì)序列進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增失敗率較高的情況，故而本實(shí)驗(yàn)主要采用葉綠體rbcL序列對(duì)天南星及其市場常見混偽品進(jìn)行鑒別研究。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)rbcL序列具有易擴(kuò)增、通用性好、Blast比對(duì)簡單的特點(diǎn)，且其鑒別效率高，可完全將天南星正品與其常見混偽品分開。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rbcL不僅可將天南星及其混偽品準(zhǔn)確區(qū)分，且在實(shí)驗(yàn)條件下擴(kuò)增成功率92.31%，測序成功率100%，鑒定成功率100%，效果均高于前人研究(擴(kuò)增成功率88.16%，測序成功率96.88%，鑒定成功率41.67%)。通過對(duì)比前人實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)前人實(shí)驗(yàn)材料大多為天南星屬植物，而本實(shí)驗(yàn)主要涉及多個(gè)屬種之間樣品的鑒別，故而推測rbcL序列對(duì)于鑒別同屬不同種物種效率較低，對(duì)于不同屬種之間的鑒別則表現(xiàn)出較高的鑒別效率。另外，前人所用實(shí)驗(yàn)材料為植物葉片，實(shí)驗(yàn)材料所選用的植株部位不同，鑒定效率可能也有所不同。

葉綠體基因組序列具有一定的保守性，且擴(kuò)增葉綠體片段的引物是通用的，便于實(shí)驗(yàn)操作，采用葉綠體片段序列進(jìn)行植物物種鑒定可避免污染(如真菌)，大大提高鑒定效率，在植物物種的分子鑒定方面具有較好的應(yīng)用前景。