張夢(mèng)夢(mèng) 蘇曉東 田毅夫 季佳宇 劉福生

2018年，世界范圍內(nèi)肝癌的發(fā)生率在所有腫瘤類型中居第6位，病死率排名第4位，嚴(yán)重威脅人類健康。僅2018年，全球共有841000例新發(fā)肝癌患者，同時(shí)782000例患者死亡[1]。原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma)，以及其他發(fā)生率低的類型。其中肝細(xì)胞癌的發(fā)生率約占原發(fā)性肝癌(liver cancers)的80%[2]。

在疾病早期確診的HCC患者可以進(jìn)行手術(shù)切除術(shù)或局部消融治療，然而，高級(jí)別的HCC患者通常只能進(jìn)行療效有限的、以減輕癥狀為目的的保守治療。目前，已被批準(zhǔn)用于高級(jí)別HCC系統(tǒng)治療的臨床藥物，僅有多重激酶抑制劑索拉菲尼(sorafenib)，臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，索拉菲尼可延長(zhǎng)高級(jí)別HCC患者中位生存期約3個(gè)月，同時(shí)化療不良反應(yīng)強(qiáng)[3]。因此，找尋新的分子靶點(diǎn)是HCC臨床研究的重要工作。

嗜乳脂蛋白家族成員含有1～2個(gè)細(xì)胞外Ig結(jié)構(gòu)域，由于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與B7家族共受體蛋白質(zhì)具有部分相似性，因此被稱為B7相關(guān)蛋白質(zhì)[4～6]。BTN3A亞家族包含3個(gè)成員，BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3，該亞家族成員被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[7, 8]。近期報(bào)道，BTN3A3及BTN3A2中特定的單核苷酸多態(tài)性分別增加卵巢癌及胃癌的發(fā)生概率[9, 10]。BTN3A3的表達(dá)情況可預(yù)測(cè)胃癌患者對(duì)氟尿嘧啶(fluorouracil)化療藥物的敏感度[11]。乳腺癌腫瘤微環(huán)境中，位于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞膜表面的LSECtin通過(guò)與乳腺腫瘤干細(xì)胞表面的BTN3A3受體結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的干性[12]。對(duì)于BTN3A家族蛋白，其在肝癌中的作用目前未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因的表達(dá)量降低，同時(shí)，低表達(dá)BTN3A3基因的肝癌患者整體生存期顯著縮短。這提示，BTN3A3可能對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。肝癌細(xì)胞系體外遷移實(shí)驗(yàn)表明，降低BTN3A3表達(dá)后促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的遷移，侵襲實(shí)驗(yàn)表明，降低BTN3A3表達(dá)后促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的侵襲，說(shuō)明BTN3A3調(diào)控肝癌細(xì)胞系的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移能力。降低BTN3A3表達(dá)后肝癌細(xì)胞系克隆形成能力增強(qiáng)，說(shuō)明BTN3A3調(diào)控單個(gè)肝癌細(xì)胞在新的位點(diǎn)增殖的能力。本研究初步明確了減少BTN3A3的表達(dá)能夠促進(jìn)肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展，有助于增加對(duì)BTN3A亞家族蛋白質(zhì)功能的了解，為發(fā)展新的高級(jí)別肝細(xì)胞癌的分子治療靶點(diǎn)提供線索。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及試劑：HLE細(xì)胞系購(gòu)自ATCC，HepG2細(xì)胞系購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞資源中心。HLE及HepG2細(xì)胞系采用DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司, C11995500BT)培養(yǎng),補(bǔ)充10%胎牛血清(杭州四季青公司, 11011-8611)和1%雙抗(美國(guó)Gibco公司, 15140-122)。

2.抗體：BTN3A3抗體購(gòu)自Proteintech公司(15896-1-AP)，β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(A5441)。

3.SiRNA轉(zhuǎn)染：SiRNA(1#-GCUCGUGGAGAG-AAGUCUUTT，2#-GCCUGACUGAUGGGAAUAATT)由蘇州吉瑪公司合成，用以敲減肝癌細(xì)胞系中BTN3A3的表達(dá)。采用Lipo3000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Life technology公司, L3000-015)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作。

4.細(xì)胞遷移分析：于200μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，加入1×105個(gè)細(xì)胞；將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)小室(美國(guó)Millipore公司, MCEP24H48)的上室中；下室加入800μl含有10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，獲取細(xì)胞培養(yǎng)小室進(jìn)行結(jié)晶紫染色(中國(guó)Beyotime公司, C0121)并拍照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.細(xì)胞侵襲分析：細(xì)胞培養(yǎng)小室采用Matrigel (美國(guó)BD公司, 356234)預(yù)包被，置于37℃孵箱中3h形成Matrigel包被層。于200μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，加入2×105個(gè)細(xì)胞；將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)小室的上室中；下室加入800μl含有20%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，獲取細(xì)胞培養(yǎng)小室進(jìn)行結(jié)晶紫染色并拍照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.細(xì)胞克隆形成分析：包含1×103個(gè)細(xì)胞的2ml細(xì)胞懸液接種于6孔板的孔中，培養(yǎng)2周后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色并統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.BTN3A3基因的表達(dá)量：采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌患者的數(shù)據(jù)，分析了BTN3A3基因在不同分期患者中的表達(dá)情況。Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因表達(dá)量顯著下降(圖1)，其中Ⅱ期患者的表達(dá)量顯著高于Ⅳ期患者(P<0.01)，Ⅲ期患者的表達(dá)量顯著高于Ⅳ期患者(P<0.05)。Ⅰ期肝癌患者中BTN3A3表達(dá)量同Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅱ期肝癌患者中BTN3A3表達(dá)量同Ⅲ期患者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Ⅳ期肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中BTN3A3表達(dá)量顯著下降*P<0.05,**P<0.01

2.低表達(dá)BTN3A3基因的肝癌患者整體生存期：采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌患者的數(shù)據(jù)，分析了BTN3A3基因的表達(dá)量與患者整體生存期之間的關(guān)系。獲取364例肝癌患者的生存期數(shù)據(jù)，并根據(jù)BTN3A3基因表達(dá)量的高低分為兩組，高表達(dá)組182例患者，低表達(dá)組182例患者，進(jìn)行整體生存期的統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。低表達(dá)BTN3A3基因的患者整體生存期顯著縮短(P<0.05)。

圖2 低表達(dá)BTN3A3的肝癌患者整體生存期顯著縮短

3.采用SiRNA成功敲減肝癌細(xì)胞系HLE及HepG2中BTN3A3的表達(dá)：采用SiRNA：1#-GCUCGUGGAGAGAAGUCUUTT，2#-GCCUGACUGAU-GGGAAUAATT，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HLE及HepG2。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot法分析(圖3)。兩株細(xì)胞系中的BTN3A3表達(dá)量在兩個(gè)靶點(diǎn)的作用下均顯著下降。

圖3 在HLE、HepG2細(xì)胞系中成功敲減BTN3A3的表達(dá)A.HLE細(xì)胞系轉(zhuǎn)染SiRNA后進(jìn)行Western blot法結(jié)果圖; B.HepG2細(xì)胞系轉(zhuǎn)染SiRNA后進(jìn)行Western blot法結(jié)果圖

4.降低BTN3A3表達(dá)后促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的遷移：采用BTN3A3-SiRNA轉(zhuǎn)染HLE及HepG2肝癌細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。降低BTN3A3表達(dá)后，兩株肝癌細(xì)胞系的遷移能力均顯著增強(qiáng)(圖4)。

圖4 HLE、HepG2細(xì)胞系中降低BTN3A3表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)A.HLE細(xì)胞系遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); B.HLE細(xì)胞系遷移實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果; C.HepG2細(xì)胞系遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); D.HepG2細(xì)胞系遷移實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果;*P<0.05, **P<0.01,***P=0.000

5.降低BTN3A3表達(dá)后促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的侵襲：采用BTN3A3-SiRNA轉(zhuǎn)染HLE及HepG2肝癌細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。降低BTN3A3表達(dá)后，兩株肝癌細(xì)胞系的侵襲能力均顯著增強(qiáng)(圖5)。

圖5 HLE、HepG2細(xì)胞系中降低BTN3A3表達(dá)后細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)A.HLE細(xì)胞系侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); B.HLE細(xì)胞系侵襲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果; C.HepG2細(xì)胞系侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); D.HepG2細(xì)胞系侵襲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果;*P<0.01,**P=0.000

6.降低BTN3A3表達(dá)后肝癌細(xì)胞系克隆形成能力：采用BTN3A3-SiRNA轉(zhuǎn)染HLE及HepG2肝癌細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。降低BTN3A3表達(dá)后，兩株肝癌細(xì)胞系的克隆形成數(shù)目顯著增加(圖6)。

圖6 HLE、HepG2細(xì)胞系中降低BTN3A3表達(dá)后細(xì)胞的克隆形成能力顯著增強(qiáng)A.HLE細(xì)胞系克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(結(jié)晶紫); B. HLE細(xì)胞系克隆形成實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果; C.HepG2細(xì)胞系克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(結(jié)晶紫); D.HepG2細(xì)胞系克隆形成實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果;*P<0.05，**P=0.000

討 論

轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了90%癌癥患者的死亡[13]。通過(guò)切除術(shù)或經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，可成功治療肝細(xì)胞癌患者的原發(fā)腫瘤，然而由于局部侵襲及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，患者復(fù)發(fā)概率高。明確肝細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，有利于發(fā)展有效的針對(duì)高級(jí)別肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，明確了Ⅳ期患者中BTN3A3基因表達(dá)量顯著降低；同時(shí)低表達(dá)BTN3A3的患者，生存期顯著縮短。設(shè)計(jì)并獲得敲減BTN3A3表達(dá)的SiRNA序列，并在肝癌細(xì)胞系HLE及HepG2中驗(yàn)證有效。進(jìn)而證實(shí)在兩株肝癌細(xì)胞系中，敲減BTN3A3的表達(dá)后，細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)克隆形成能力顯著增強(qiáng)。初步證實(shí)了BTN3A3在肝癌惡性進(jìn)展中的抑制作用。

根據(jù)AJCC對(duì)于肝癌的分期定義，Ⅳ期患者發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在該分期的患者中，BTN3A3基因的表達(dá)量顯著降低。由此推斷，BTN3A3可能存在抑制肝癌轉(zhuǎn)移的功能，低表達(dá)該基因的患者，對(duì)腫瘤侵襲的抑制作用降低，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究所獲取的ATCC數(shù)據(jù)庫(kù)中的患者數(shù)據(jù)，Ⅳ期患者為6例，數(shù)目較少，因此還有待增加病例數(shù)后進(jìn)一步驗(yàn)證。

針對(duì)364例肝癌患者的生存期數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)BTN3A3基因的患者整體生存期顯著縮短。這說(shuō)明低表達(dá)該基因，不利于肝癌患者的疾病控制，BTN3A3具有在肝癌惡性進(jìn)展中的抑制作用。同時(shí)，肝癌患者生存期分析的結(jié)果，也支持前述Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因表達(dá)量顯著下降的結(jié)論。

在轉(zhuǎn)移發(fā)生過(guò)程中，一個(gè)位于原發(fā)腫瘤灶的癌細(xì)胞有序地發(fā)生下列變化，原位侵入周圍組織，進(jìn)入淋巴系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的微管，存活，通過(guò)血液系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)處組織的微血管中，穿出血管，在遠(yuǎn)處組織微環(huán)境中存活，適應(yīng)新的環(huán)境，增殖并形成新的轉(zhuǎn)移灶[14]。采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室驗(yàn)證敲減BTN3A3后肝癌細(xì)胞系的遷移及侵襲能力，結(jié)果顯示，敲減BTN3A3表達(dá)后，細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng)。遷移分析體現(xiàn)了肝癌細(xì)胞系在敲減BTN3A3表達(dá)后，在淋巴系統(tǒng)及血液系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，而侵襲分析體現(xiàn)了肝癌細(xì)胞系侵入周圍組織能力增強(qiáng)。這都有利于肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

克隆形成實(shí)驗(yàn)初步體現(xiàn)了單個(gè)腫瘤細(xì)胞在到達(dá)新的組織微環(huán)境中存活和定殖的能力。敲減BTN3A3基因表達(dá)后，肝癌細(xì)胞系的克隆形成能力顯著增強(qiáng)，這提示該基因的表達(dá)降低有利于轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生。

當(dāng)前，關(guān)于BTN3A3在腫瘤中的具體調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道。在胃癌中，Pan等[11]采用生物信息及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，明確了BTN3A3對(duì)化療藥物氟尿嘧啶有效性的預(yù)測(cè)作用。在卵巢癌中，Peedicayil等[10]采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，證實(shí)BTN3A3的SNPs與卵巢癌的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。然而兩項(xiàng)研究均未進(jìn)行分子機(jī)制的研究。在乳腺癌中，位于巨噬細(xì)胞膜表面的LSECtin蛋白與位于乳腺癌細(xì)胞膜表面的BTN3A3結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)JAK2/STAT3信號(hào)通路活性，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的干性[12]。這一研究結(jié)果提示，在肝癌中BTN3A3可能也發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞干性的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)移發(fā)生前期，腫瘤細(xì)胞通過(guò)表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)作用，增加自身可塑性及干性，以利于轉(zhuǎn)移的進(jìn)行。筆者推斷，肝癌細(xì)胞中BTN3A3基因極有可能在EMT過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。在后續(xù)的深入研究BTN3A3抑制肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制中，筆者將以此為切入點(diǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)BTN3A3基因在Ⅳ期肝癌患者中表達(dá)量顯著下降，低表達(dá)該基因的患者整體生存期顯著縮短。在細(xì)胞水平明確了敲減BTN3A3表達(dá)后，肝癌細(xì)胞系HLE及HepG2的細(xì)胞遷移、侵襲及克隆形成能力均顯著增強(qiáng)，初步證實(shí)了BTN3A3在肝癌惡性進(jìn)展中的抑制作用。這將為后續(xù)深入研究BTN3A3抑制肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供支持，同時(shí)為探索新的有效的針對(duì)高級(jí)別肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)提供線索。