陳祥娃，霍婷婷，董發(fā)勤，劉靳波，鄧建軍,3

(1.西南醫(yī)科大學 附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000； 2. 西南科技大學 固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室，四川 綿陽 621010； 3. 四川綿陽四O四醫(yī)院，四川 綿陽 621000)

近年來頻發(fā)的區(qū)域性霧霾天氣主要與高濃度的細顆粒物2.5(PM2.5)相關。有研究表明礦物粉塵是大氣顆粒物的主要成分之一，如硅質礦物石英、硫酸鹽礦物石膏及芒硝等(徐宗澤等, 2019)。楊潔等(2017)利用X射線衍射光譜儀檢測到可吸入細顆粒物PM2.5中主要礦物成分為石英，并證實其能抑制細胞增殖，使細胞周期G2/M期阻滯。有研究報道，空氣污染物與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率有關(Newbyetal., 2015; Caietal., 2016)。鼻咽喉、氣道和肺是大氣中石英粉塵攻擊人體的直接靶器官，流行病學研究已經表明，大氣污染與呼吸道炎癥發(fā)病率的增加和肺功能下降密切相關(Zhaoetal., 2019)。體內外實驗也證實，大氣顆粒物的急性暴露可誘導支氣管高反應性(bronchial hyper reactivity, BHR)、氣道炎癥的發(fā)生，釋放IL-6與IL-8等炎癥因子，發(fā)揮其促進細胞增殖、誘導發(fā)熱反應等生理學功能(Guoetal., 2017; Oginoetal., 2018)。 目前，大氣顆粒物的細胞毒理效應所涉及的機制主要有氧化應激、炎癥信號傳導途徑活化、DNA損傷和表觀遺傳學改變等(Liuetal., 2018; Yangetal., 2018; Wangetal., 2019; Lietal., 2019)，其中炎癥信號轉導途徑的活化會誘導細胞產生高水平的炎癥因子，使組織發(fā)生滲出、增生、變質、肉芽腫等病理變化，進而發(fā)展為肺部纖維化、自發(fā)性氣胸、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)。Toll樣受體4(toll like receptor,TLR4)信號途徑在調控炎癥反應、先天性免疫應答上起關鍵作用，其可被各種病原/危險相關分子模式激活，參與了各種炎癥因子的產生過程。TLR4受體多分布在巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞膜表面，但其在石英粉塵致人支氣管上皮細胞(16 human bronchial epithelial cells, 16HBE)炎癥反應中的作用少有報道，故本研究采用16HBE細胞作為石英粉塵染毒對象，探討石英粉塵對16HBE細胞炎癥反應的機制，以期在分子生物學層面對其致氣道炎癥機制進行更深入的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

主要試劑有Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培養(yǎng)基 (DMEM, 含4mM L-谷氨酰胺)(Hyclone)、胰酶消化液、青鏈霉素雙抗溶液(碧云天)、胎牛血清(Gibco)、CCK-8(cell counting kit-WST8)、Human IL-6 ELISA Kit、Human IL-8 ELISA Kit(BOSTER)、TAK-242(MCE)、全蛋白抽提試劑盒(凱基)和抗TLR4抗體(CST)。

主要儀器有X射線衍射光譜儀(X’pert PRO, PANalytical)、倒置相差熒光顯微鏡( Axio ObserverA1, Zeiss) 、全波長酶標儀 ( PowerWave XS2, BioTek)、蛋白電泳儀(Power Supplies Basic, Bio-rad)、凝膠成像系統(BOXChemiXR5, SYNGENE G)。

1.2 實驗方法

1.2.1 石英粉塵物相分析

石英粉塵由西南科技大學固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室提供，經臥式行星球磨機研磨、烘干后得到粒徑≤2.5 μm的石英粉塵樣本。采用X射線衍射光譜儀，利用Cu Ka輻射(k=1.541 78 ?)對樣本進行物相鑒別。

石英粉塵樣本經高壓蒸汽滅菌處理后，溶解于DMEM基礎培養(yǎng)基，超聲震蕩30 min配制為1 000 μg/mL的母液，并依次稀釋至實驗所需濃度。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

人支氣管上皮細胞來源于廣州呼吸系統疾病研究所，細胞所用完全培養(yǎng)基含有90% DMEM，并添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%青鏈霉素雙抗溶液(含100 U/mL的青霉素、0.1 mg/mL的鏈霉素)。將細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的飽和濕度環(huán)境中。待細胞貼壁密度達80%～90%，消化細胞以1∶2的比例傳代于T25 cm2培養(yǎng)瓶中。每次實驗之前，要求細胞的貼壁密度達80%左右。

1.2.3 細胞相對存活率檢測

使用DMEM完全培養(yǎng)基調整16HBE細胞懸液濃度為1.0×105/mL，以100 μL/孔的體積接種于96微孔板中，培養(yǎng)至細胞貼壁密度為80%左右，依次加入終濃度為0(對照)、25、50、75、100、125、150、175、200和250 μg/mL的石英粉塵懸液，每個濃度設置3個復孔。為消除顆粒物背景對于光密度(OD值)的影響，每個濃度都設置其對應的背景孔(僅含相應濃度的石英粉塵懸液)。染毒24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，避光孵育1.5 h后于450 nm處測定每個孔的OD值，并按以下公式計算細胞相對存活率： 細胞相對存活率(%)=(OD實驗孔-OD對應背景孔)/(OD對照孔-OD對應背景孔)×100%。

1.2.4 ELISA法檢測染毒后細胞上清液中IL-6、IL-8濃度

調整細胞懸液濃度為1.0×105/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞貼壁密度為80%左右。依次加入終濃度為0(對照)、25、50、75、100 μg/mL的石英粉塵懸液，每個濃度做3個復孔。染毒24 h后取上清液，3 000 r/min、4℃離心5 min后收集上清液，1∶2稀釋。按照試劑盒說明書進行實驗。

1.2.5 Western Blot檢測染毒后細胞裂解液中TLR4的表達情況

使用全蛋白抽提試劑盒提取各濃度石英粉塵懸液處理后的16HBE細胞裂解液中的總蛋白質，以15 μL/孔的上樣量加入10%的分離膠上進行蛋白質分離，然后轉移到硝酸纖維素薄膜(NC膜)上。將膜在5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，爾后把膜置于含抗TLR4抗體(1∶1 000稀釋)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。之后吸取一抗，TBST緩沖液洗膜3次，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫搖床振蕩反應1.5 h，滴加ECL發(fā)光工作液，并使用G:BOX chemiXR5系統獲得蛋白條帶圖像，Gel-Pro32軟件測量條帶灰度值。

1.2.6 TLR4抑制劑預處理后細胞上清液中IL-6、IL-8的濃度檢測

為了驗證TLR4在氣道炎癥中的作用，將TAK 242(1 μg/mL，每孔2 mL)對細胞進行1 h的預處理，再依次加入終濃度為0、25、50、75、100 μg/mL的石英粉塵懸液，后續(xù)操作同1.2.4。

1.2.7 統計學分析

定量數據以“均數±標準差”的形式表示，聯合Excel和SPSS17.0對其進行計算和差異性比較，在數據滿足正態(tài)分布且方差齊的前提下，兩組間樣本均數的比較采用單因素方差分析，否則采用校正t檢驗(t’檢驗)。P<0.05 表示差異有統計學意義；P<0.01表示差異有顯著統計學意義。所有圖形使用GraphPad Prism 8.0和Origin 8.2.0進行繪制。

2 實驗結果與數據分析

2.1 石英粉塵的XRD圖譜

由石英粉塵的X射線衍射圖譜(圖1)可知，本次研究的大氣顆粒物中主要物相為石英，并含有少量方解石。

圖 1 石英粉塵的XRD衍射圖Fig.1 XRD diffraction diagram of quartz dust

2.2 石英粉塵染毒后16HBE細胞存活率

不同濃度的石英粉塵懸液染毒16HBE細胞24 h后，細胞相對存活率的變化如圖2所示。圖中，*表示與對照組相比，P<0.05;**表示與對照組相比，P<0.01。與對照組相比,各個濃度的石英粉塵懸液都降低了細胞存活率。當濃度介于0～100 μg/mL時，細胞存活率維持在60%以上。濃度為200與250 μg/mL時，細胞存活率顯著降低，分別為(52.43±3.99)%和(48.81±7.87)%。

2.3 石英粉塵及抑制劑處理后細胞IL-6與IL-8表達水平

與對照組相比，使用1 μg/mL的TAK 242處理16HBE細胞24 h未對細胞存活率造成影響(圖3)。

圖 2 石英粉塵對16HBE細胞相對存活率的影響Fig. 2 Effects of quartz dust on 16HBE cell relative survival ratio

圖 3 抑制劑對16HBE細胞相對存活率的影響Fig. 3 Effects of inhibitor on 16HBE cell relative survival ratio

如圖4所示，隨著石英粉塵懸液濃度增加，細胞因子IL-6與IL-8的表達呈現遞增趨勢，當石英粉塵懸液濃度為100 μg/mL時，與對照組相比，IL-6濃度顯著增加，為348.47±20.49 pg/mL(表1)。當懸液濃度為50、75、100 μg/mL時，IL-8濃度顯著增加，分別為667.81±69.56、677.17±31.85 和844.63±37.32 pg/mL。 此外，用抑制劑TAK 242預處理1 h后，50、75、100 μg/mL濃度組的細胞因子IL-6與IL-8表達降低。 圖4中，TAK 242(-)表示未使用該物質預處理細胞，僅使用了石英粉塵處理；TAK 242(+)表示使用1 μg/mL的TAK 242預處理細胞1 h再進行染毒實驗；*表示與對照組相比，P<0.05；**表示與對照組相比，P<0.01；#表示與未使用抑制劑的相同石英粉塵濃度組相比，P<0.05；##表示與未使用抑制劑的相同石英粉塵濃度組相比，P<0.01。

圖 4 石英粉塵及抑制劑處理后16HBE細胞IL-6與IL-8的相對表達Fig. 4 Relative expression of IL-6 and IL-8 in 16HBE cells treated with quartz dust and inhibitor

表 1 石英粉塵和抑制劑對16 HBE細胞IL-6和IL-8表達的影響

Table 1 Effects of quartz dust and inhibitor on the expression of IL-6 and IL-8 in 16HBE cells

石英粉塵濃度/(μg·mL-1)IL-6濃度/(pg·mL-1)IL-8濃度/(pg·mL-1)TAK 242(-)TAK 242(+)TAK 242(-)TAK 242(+)對照215.69±25.99200.14±13.50387.65±60.60355.75±10.1825266.25±8.21241.25±49.08570.98±42.86?259.56±19.3150274.86±11.31?185.97±0.96##667.81±69.56??477.97±7.76#75300.69±41.97?189.58±3.63#677.17±31.85??470.67±28.46##100348.47±20.49??226.53±30.69##844.63±37.32??597.81±42.72##

2.4 石英粉塵處理后細胞TLR4表達水平

如圖5所示，TLR4的表達量隨石英粉塵懸液濃度增加而上調。相同濃度的石英粉塵染毒條件下，使用TAK 242預處理組較未使用組的TLR4表達量降低。經內參蛋白GAPDH校正后，與對照組相比，50～100 μg/mL濃度組的TLR4表達明顯增加(P<0.01)，100 μg/mL組的TLR4表達為對照組的11.45倍，差異具有統計學意義。

圖 5 石英粉塵和TAK 242對16HBE細胞TLR4表達的影響Fig. 5 Effects of quartz dust and TAK 242 on the expression of TLR4 in 16HBE cells

3 討論

大氣細顆粒物污染除造成霧霾天氣、降低空氣能見度外，已成為我國的一個重大公共衛(wèi)生問題。經濟發(fā)展過程中，建筑施工、渣土運輸、工業(yè)化采礦、水泥(粉煤灰)制磚等都會造成大氣細顆粒物濃度上升，當這些固體物質分散并懸浮在氣體介質中便形成氣溶膠，并可通過呼吸系統進入機體。大氣細顆粒物因直徑極小，吸入后易沉積在肺組織，甚至可以通過氣-血屏障擴散進入血液，導致氣道炎癥和系統性炎癥的發(fā)生。Huang等人搜集的流行病學數據表明，當大氣顆粒物濃度大于38.98 μg/m3時，非吸煙健康人群對COPD的易感性增加(Huangetal.,2019)。大量體內外實驗證實，暴露于高濃度的大氣顆粒物環(huán)境下，會導致肺功能下降以及誘導變應性氣道疾病、急性氣道炎癥、哮喘等疾病的發(fā)生(Zhouetal., 2016; Shenetal., 2018)。

炎癥反應被認為是大氣細顆粒物引發(fā)肺部損傷的基本病理過程。暴露于霧霾環(huán)境下可能導致健康人發(fā)生鼻腔炎癥和超敏反應，鼻腔分泌物中NO、IL-5、IL-8、P物質、神經生長因子和血管活性腸肽的水平顯著增加(Xianetal., 2019)。礦物是大氣顆粒物的主要成分之一，本次實驗結果顯示，微米級石英粉塵顆粒染毒后會引起16HBE細胞上清液中IL-6與IL-8水平顯著增加。IL-6已被確定為關鍵的免疫調節(jié)多肽類細胞因子，有促進細胞增殖、誘導發(fā)熱反應的作用，是COPD患者的預后生物標志物(Wuetal., 2017)，其還被證明為上皮間充質轉化的觸發(fā)因素(Browningetal., 2018)。IL-8屬于趨化因子家族的一員，主要功能為募集白細胞到炎癥發(fā)生部位，并誘導其釋放一系列生物活性產物引起組織損傷。研究發(fā)現，大氣顆粒物染毒后的肺組織中有豐富的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤(Oginoetal., 2017； Xuetal., 2019)，本次研究檢測到的高IL-8表達與此實驗結果相符合。

高濃度炎癥因子的表達與分泌由TLR4信號途徑進行調控。TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，當配體與髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation-2,MD-2)結合，會導致TLR4二聚化，胞內區(qū)形成Toll白介1受體 (toll interleukin 1 receptor,TIR)結構域(Gayetal., 2007)。TAK 242可特異性地與TIR結構域結合，阻止其活化下游的銜接蛋白。本次研究表明，1 μg/mL的TAK 242處理16HBE細胞24 h后不會影響細胞的存活率，故可采用其作為研究TLR4信號通路的抑制劑。本研究證實TAK 242可以有效降低細胞上清液中IL-6與IL-8的濃度，推測TLR4轉導途徑的活化可能是石英粉塵致支氣管炎癥反應的潛在分子機制。Xu等(2018)使用TAK 242預處理小鼠巨噬細胞(RAW264.7)后，大氣細顆粒物刺激產生的高濃度IL-1β現象被抑制，此外，免疫調節(jié)關鍵核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的表達也在TAK 242預處理后明顯下調，證明TLR4信號通路與NF-κB信號通路間存在交叉，形成信號調節(jié)網絡以維持機體響應大氣細顆粒物刺激的免疫反應發(fā)生。

NF-κB是一種轉錄因子，可與炎癥因子基因的啟動子區(qū)結合從而上調其表達，如圖6所示，除NF-κB 外，TLR4通路還包含了很多信號分子。在本次研究中，僅對細胞膜上的“信號開關”TLR4蛋白進行了檢測，觀察到TLR4的表達隨石英粉塵懸液濃度增加而上調，然而卻未對TLR4信號軸下游的蛋白，如髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)、β-干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR domain containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)與石英粉塵之間的關系進行探索。此外，XRD分析顯示本次實驗所用的大氣顆粒物主要物相為石英，研究表明(Rathinametal., 2013)TLR4的主要配體為細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，本實驗將顆粒物置于103.4 kPa、121.3°C的條件下進行30 min的滅菌處理，不會造成LPS的丟失，因此需要進一步研究TLR4的激活是與LPS還是石英有關。深入了解TLR4及其上下游分子對炎癥介質釋放的影響，可以針對性地研制出大氣中石英粉塵所致肺部疾病的治療干預措施，這將是我們下一步的研究內容。

圖 6 TLR4信號通路活化模式圖Fig. 6 Activation pattern diagram of TLR4 signal pathway

4 結論

(1) 石英粉塵作用于16HBE細胞后，會刺激其分泌高濃度的IL-6與IL-8。

(2) TLR4特異性抑制劑TAK 242可以拮抗石英粉塵引發(fā)的高水平炎癥因子和TLR4。

(3) 石英粉塵可激活 16HBE細胞的TLR4信號通路，誘導氣道炎癥反應的發(fā)生。