瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發(fā)性肝癌的機(jī)制研究

俞力 劉蘇

原發(fā)性肝癌是當(dāng)前常見的人類惡性腫瘤之一[1]。肝癌的病情的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等與多種基因突變、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等分子水平機(jī)制密切關(guān)聯(lián)[2]。尋找一個(gè)有效的、敏感性及特異性較強(qiáng)的生物學(xué)靶點(diǎn)已成為臨床治療原發(fā)性晚期肝癌及阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的研究的熱點(diǎn)。本研究探討瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發(fā)性肝癌的機(jī)制研究。

資料與方法

一、一般資料

本研究于2016年1月至2018年10月間收集于本院就診并接受治療的原發(fā)性晚期肝癌患者60例，全部經(jīng)病理學(xué)確診；本研究中受試對(duì)象的平均發(fā)病年齡為 (53.61±9.59)歲。研究中的排除標(biāo)準(zhǔn)：研究排除近期(半年內(nèi))使用過VEGFR-TKI小分子藥物治療者；排除同時(shí)罹患高血壓、冠心病等疾病患者；排除吞咽困難、慢性腹瀉、消化潰瘍等腸道疾病者以及懷孕或哺乳期女性患者。本研究中患者使用的治療方案如下：口服瑞戈非尼(160 mg)，服藥時(shí)間和療程細(xì)則：d1～d21，28 d為一個(gè)療程。療效判斷依據(jù)RECIST完成評(píng)定，并計(jì)算總有效率。

二、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BRAF的蛋白表達(dá)水平

取原發(fā)性晚期肝癌患者癌組織石蠟切片標(biāo)本，加入單克隆抗體BRAF和堿性磷酸酶二抗，進(jìn)行4 ℃過夜孵育，次日加入SP和DAB進(jìn)行顯色，封片并用顯微鏡進(jìn)行觀察。計(jì)算癌組織中BRAF蛋白表達(dá)的平均光密度(mean density)。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞存活率

選取人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，使用胎牛血清作為RPMI培養(yǎng)液，濃度為10%，溫度控制在37 ℃，同時(shí)在5% CO2條件下進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。研究總共取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)分析，(細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn))，用瑞戈非尼(0.5 μmol/L，24 h)處理SMMC-7721細(xì)胞后更換培養(yǎng)基，再加入CCK8(10 μL)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度仍然控制字37℃，同時(shí)在5% CO2條件下完成培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2 h，最后使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定)，研究中通過比較分析細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率討論主題。

四、劃痕實(shí)驗(yàn)

劃痕實(shí)驗(yàn)中首先使用用瑞戈非尼0.5 μmol/L處理SMMC-7721細(xì)胞，24 h后將細(xì)胞接種于96孔板上，隨后使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96 孔板下端中央，輕推形成劃痕。漂洗(使用無血清培養(yǎng)基)3遍后加入低濃度血清培養(yǎng)24 h，最后對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力進(jìn)行評(píng)估。

五、Western Blot檢測(cè)蛋白含量表達(dá)

收取肝癌組織及SMMC-7721細(xì)胞株的蛋白并檢測(cè)蛋白濃度(總量調(diào)整為30 μg/μL)。將各組肝癌組織及SMMC-7721細(xì)胞株蛋白樣品進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，BSA封閉后加入BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2、NF-κB、BCL-2和Caspase 3蛋白的表達(dá)一抗和堿性磷酸酶二抗。用顯色劑顯色并對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描分析，計(jì)算肝癌組織及SMMC-7721細(xì)胞株BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2、NF-κB、BCL-2和Caspase 3蛋白的表達(dá)蛋白的表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)/等級(jí)資料采用例數(shù)和百分比描述，卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差別的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05(提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

結(jié) 果

一、臨床療效觀察

瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發(fā)性肝癌總有效率為58.33%(35/60)。

二、免疫組化結(jié)果

原發(fā)性肝癌應(yīng)用瑞戈非尼靶向治療后，癌組織內(nèi)BRAF蛋白平均光密度含量明顯下降 (P<0.05)，見圖1。

圖1 BRAF免疫組化結(jié)果 (DAB顯色×400)

三、SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞存活率、遷移和侵襲能力結(jié)果

研究中對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株使用瑞戈非尼處理24 h后，可見細(xì)胞存活率顯著降低，同時(shí)凋亡率顯著增高，同時(shí)可見細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱(P<0.05)，見圖2。

圖2 肝癌SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞存活率、遷移和侵襲能力結(jié)果

四、Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

原發(fā)性肝癌患者應(yīng)用瑞戈非尼靶向治療后，癌組織內(nèi)BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量顯著降低，NF-κB和Caspase 3蛋白含量顯著升高(P<0.05)，見表1。本研究結(jié)果提示，SMMC-7721細(xì)胞株使用瑞戈非尼處理后，癌細(xì)胞內(nèi)BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量均可見水平顯著降低，而NF-κB和Caspase 3蛋白含量則可見顯著升高(P<0.05)，見表2。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)Raf基因家族成員中的癌基因BRAF與原發(fā)性肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，該基因發(fā)揮調(diào)控作用的通路為絲分裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]，Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)通路是MAPK通路的下游信號(hào)系統(tǒng)，主要通過細(xì)胞外信號(hào)傳遞入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特異蛋白表達(dá)水平[4]。細(xì)胞外信號(hào)分子一旦通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或其他方式引發(fā)機(jī)體應(yīng)激時(shí)，BRAF就會(huì)發(fā)揮MAPKKK的作用，并激活ERK影響細(xì)胞的增殖分化[5]。與此同時(shí)，NF-kB是磷脂酰肌醇-3-羥激酶PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK下游的主要效應(yīng)靶蛋白，其具有調(diào)控細(xì)胞凋亡基因轉(zhuǎn)錄等功能[6]，并且它可以抑制BCL-2表達(dá)，導(dǎo)致凋亡蛋白caspase 3活化以及凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發(fā)性肝癌總有效率為58.33%，療效顯著。原發(fā)性肝癌應(yīng)用瑞戈非尼靶向治療后，癌組織內(nèi)BRAF蛋白平均光密度含量明顯下降，說明瑞戈非尼可有效抑制肝癌組織內(nèi)BRAF表達(dá)、下調(diào)信號(hào)通路等方式影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。當(dāng)采用瑞戈非尼0.5 μmol/L處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞株24h后，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱，說明瑞戈非尼能持續(xù)抑制肝癌細(xì)胞的癌基因，肝癌SMMC-7721細(xì)胞株應(yīng)用瑞戈非尼處理后，癌細(xì)胞內(nèi)BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)，NF-κB和Caspase 3蛋白含量顯著升高(P<0.05)，瑞戈非尼能夠抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，調(diào)控BRAF-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，使用瑞戈非尼進(jìn)行分子靶向治療，通過針對(duì)BRAF基因的干預(yù)完成對(duì)原發(fā)性肝癌的治療，主要機(jī)制為直接調(diào)控BRAF-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路，通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡完成治療。希望基于本研究可以為瑞戈非尼的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

表1 Western Blot檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者癌組織內(nèi)蛋白表達(dá)含量

注： 與治療前相比，*P<0.05

表2 Western Blot檢測(cè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株內(nèi)蛋白表達(dá)含量

注： 與治療前相比，*P<0.05