王萌　蔣蕓　趙世豪　萬劉靈　張文麗　伍娟　 程宇

摘要：以游離脂肪酸釋放量為指標(biāo)，通過pH-stat方法考察脂肪酶、膽鹽、CaCl2濃度對大豆油O/W乳狀液在靜態(tài)胃消化和動態(tài)胃消化模型中脂肪消化的影響。結(jié)果表明，乳狀液消化過程符合一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt。脂肪酶活性升高可增大脂肪酸釋放速率，增加脂肪酸釋放量。在一定濃度范圍內(nèi)，膽鹽和CaCl2濃度增加可提高脂肪酸釋放速率，增大游離脂肪酸釋放量。在相同消化條件下，乳狀液中的脂肪在動態(tài)消化模型中的消化程度高于靜態(tài)消化模型。

關(guān)鍵詞：乳狀液;pH-stat;體外消化模型;脂肪酸釋放

中圖分類號：TS201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0221-05

隨著人們生活水平的提高，體質(zhì)量超標(biāo)導(dǎo)致的肥胖已經(jīng)成為影響人們健康的因素之一。通常，控制脂肪的消化進(jìn)而調(diào)控其吸收被認(rèn)為是實現(xiàn)體質(zhì)量控制的有效手段之一[1]。食品乳狀液是食品中脂肪存在的主要形式之一，因而關(guān)于食品乳狀液中脂肪消化的研究受到了關(guān)注。目前，模擬消化模型結(jié)合pH-stat法是研究食品乳狀液中脂肪消化的主要手段[2]。然而，由于脂肪消化主要發(fā)生在腸消化階段，因而這些模型通常只是考察腸消化階段的影響而較少考慮胃消化階段對乳狀液中脂肪在后續(xù)腸消化階段的影響。同時，不同研究人員使用的消化模型存在一定差異，因而多國科學(xué)家共同討論出了一個標(biāo)準(zhǔn)化的靜態(tài)消化模型[3]來消除模型帶來的差異，這一模型在目前的研究中被廣泛地用于脂肪消化研究。但是由于是通用模型，這一模型并未探討脂肪酶活性和膽酸鹽濃度這2個對脂肪消化影響較為顯著的因素[4]對乳狀液中脂肪消化的影響。此外，研究表明，外源鈣離子濃度對乳狀液中脂肪消化有顯著影響[5]，這一模型中同樣未涉及。因此，本研究擬以模型乳狀液為對象，考察靜態(tài)胃消化和動態(tài)胃消化、脂肪酶活性、膽酸鹽濃度以及鈣離子濃度對乳狀液在腸消化過程中脂肪消化的影響，為含乳狀液食品的開發(fā)和配方設(shè)計提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

胃蛋白酶Pepsin（酶活性250 U/mg）、脂肪酶Lipase（酶活性38 U/mg）、Tween 20，購自美國Sigma-Aldrich 試劑公司;豬膽鹽、CaCl2及其他試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福臨門大豆油，購買于當(dāng)?shù)爻?實驗室用水為去離子水，自制。

HG15A高速分散機(jī)，大韓科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);AH-basic 型高壓均質(zhì)機(jī)，ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司生產(chǎn);KMO-2B 磁力攪拌器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（IKA中國）生產(chǎn);蠕動泵 BT/01L，保定雷弗流體科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳狀液的制備

將大豆油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.125%的Tween20溶液（100 mmol/L醋酸緩沖液、pH值為3）以1 ∶9質(zhì)量比混合后用高速分散機(jī)在21 600 r/min下乳化2 min，再用高壓均質(zhì)機(jī)將乳狀液在30 MPa下均質(zhì)2次，得到乳狀液。

1.2.2 體外模擬消化 （1）乳狀液的靜態(tài)消化模型。靜態(tài)消化模型參考 Minekus等的方法[3]。取樣品10 mL置于酶解杯中并在 37 ℃下保溫 5 min，接著加入 6.4 mL模擬胃液濃縮液和5 μL CaCl2溶液，混勻后分別加入0.360 mL 1 mol/L HCl和1.635 mL 超純水，調(diào)pH值至3.0后加入 1.6 mL 胃蛋白酶溶液（25 000 U/mL），在 37 ℃、100 r/min 條件下模擬胃消化2 h。然后，在消化液中加入 1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 7.0，接著分別加入 11 mL 模擬腸液濃縮液、2.5 mL豬膽鹽溶液、40 μL CaCl2溶液、1.460 mL超純水，混勻后加入 5 mL 脂肪酶，在 37 ℃、100 r/min 條件下保持pH值為7模擬腸消化1 h。

（2）乳狀液的動態(tài)消化模型。動態(tài)消化模型中只考慮動態(tài)胃模型，腸消化為靜態(tài)。動態(tài)消化模型參考劉運(yùn)的方法[6]。取配制好的樣液 10 mL 在 37 ℃ 下溫育 5 min，向消化體系中以恒定的速率42 L/min 同時滴加模擬胃液（8 mL模擬胃液濃縮液、320 mg 胃蛋白酶、5 μL CaCl2溶液、2 mL 超純水）和鹽酸（1 mol/L），在 37 ℃、100 r/min條件下反應(yīng) 2 h;胃消化結(jié)束后加1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH值至7，靜置2 min后，腸消化同（1）。

1.2.3 乳狀液中游離脂肪酸釋放量

參考 Li等的方法[2]計算消化過程中脂肪酸的釋放量。游離脂肪酸釋放的百分比（FFA）計算公式如下：

式中：V為消耗NaOH溶液的體積，L;C為NaOH溶液的濃度，mol/L;m為消化體系中三?；视偷目傎|(zhì)量，g;M為三?；视偷钠骄肿淤|(zhì)量，大豆油為876.56 g/mol。

1.2.4 消化條件對乳狀液中脂肪消化的影響 在腸消化試驗中，調(diào)節(jié)脂肪酶、膽鹽的添加量，考察脂肪酶活性（終濃度19、38、76 U/mL）、膽鹽濃度（終濃度0、5、10、20 mg/mL）對乳狀液脂肪酸釋放的影響。

1.2.5 CaCl2的添加對乳狀液中脂肪消化的影響 在腸消化試驗中，調(diào)節(jié)CaCl2的添加量，考察CaCl2 濃度（0、5、10、20 mmol/L）對乳狀液脂肪酸釋放的影響。

1.2.6 乳狀液消化過程中顯微結(jié)構(gòu)的表征 在消化過程中取不同消化時間（胃消化0、1、2 h，腸消化0、1、2 h）的消化樣品置于顯微鏡載玻片，在顯微鏡（物鏡40×）下觀察乳狀液經(jīng)過消化樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗進(jìn)行3次重復(fù)。單次重復(fù)試驗在不同時間進(jìn)行，并設(shè)置至少2次平行試驗。試驗數(shù)據(jù)的差異性通過DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)差異性的分析方法為LSD法，顯著差異用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽鹽對乳狀液中脂肪消化的影響

乳化脂肪在消化的過程中，具有高表面活性的膽鹽會替代乳化脂肪表面的乳化劑吸附在脂肪表面，使脂肪酶可以吸附在脂肪表面水解脂肪形成游離脂肪酸，因而膽鹽對脂肪消化有明顯影響。如圖1所示，以消化時間和游離脂肪酸釋放量分別為變量和因變量，利用一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt對不同模型中不同膽鹽濃度下乳狀液中脂肪消化的曲線進(jìn)行擬合，得到擬合曲線的回歸系數(shù)R2在0.974～0.997范圍，表明一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt可以較好地描述游離脂肪酸釋放隨時間的變化。

在乳狀液中，脂肪處于乳化的狀態(tài)，有利于脂肪酶在界面上的吸附，因而在不添加膽鹽的情況下乳狀液中脂肪也會被脂肪酶消化。但是不添加膽鹽時，乳狀液中脂肪消化程度不高，游離脂肪酸的釋放速率較低且釋放總量較低;在0～5 min腸消化過程，乳狀液在靜態(tài)胃腸模型中游離脂肪酸的平均釋放速率是動態(tài)胃腸模型的1.47倍。但是提高膽鹽濃度后，乳狀液在動態(tài)胃腸模型中前5 min的游離脂肪酸平均釋放速率有較大增加，是靜態(tài)胃腸模型的1.22倍。在0～5 min腸消化過程，添加10 mg/mL 膽鹽的乳狀液中游離脂肪酸的平均釋放速率在靜態(tài)胃腸和動態(tài)胃腸模型消化模型中分別比未添加時提高了0.46、1.62倍，游離脂肪酸總釋放量提高了21.6%、32.1%，平均反應(yīng)速率常數(shù)k提高了31.7%、91.2%。游離脂肪酸釋放速率和釋放量的結(jié)果表明，膽鹽濃度對乳狀液中脂肪消化有較大影響。

從圖1還可以看出，合適的膽鹽濃度（10 mg/mL）會促進(jìn)脂肪的消化，繼續(xù)提高膽鹽濃度（從10 mg/mL提高到20 mg/mL）則不利于脂肪的消化。這可能是由于膽鹽濃度過高，膽鹽會占據(jù)過多脂肪的表面，從而不利于脂肪酶的吸附，并限制了脂肪酶與底物的接觸。可見，乳化脂肪界面組成對脂肪有較大影響，改變界面組成可能是調(diào)控脂肪消化的一個有效手段[7]。

2.2 脂肪酶活性對乳狀液中脂肪消化的影響

脂肪經(jīng)過脂肪酶的消化會形成游離脂肪酸，改變脂肪酶的活性則可能影響脂肪的消化，從而改變游離脂肪酸的釋放速率和釋放量。如圖2所示，提高脂肪酶活性不僅提高了消化前5 min的游離脂肪酸平均釋放速率，還可以增加游離脂肪酸的釋放量。這可能與增加脂肪酶活性提高了酶底比，增加了酶和底物的接觸有關(guān)。在靜態(tài)胃腸消化模型中，脂肪酶活性從19 U/mL提高到38、76 U/mL，乳狀液前5min的游離脂肪酸平均釋放速率分別提高了1.0、1.7倍，游離脂肪酸的總釋放量分別提高了36.6%、70.0%。在動態(tài)胃腸消化模型中，脂肪酶活性從19 U/mL提到38、76 U/mL，乳狀液前5 min的游離脂肪酸平均釋放速率分別提高了1.0、2.0倍，游離脂肪酸的總釋放量分別提高了31.8%、81.8%。以消化時間和游離脂肪酸釋放量分別為變量和因變量，利用一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt對不同模型中不同脂肪酶活性（19、38、76 U/mL）下乳狀液中脂肪消化的曲線進(jìn)行擬合，得到擬合曲線的回歸系數(shù)R2在0.992～0.998范圍，因此模型可以較好地反映數(shù)據(jù)的變化趨勢。乳狀液中脂肪在靜態(tài)胃腸和動態(tài)胃腸消化模型消化的平均反應(yīng)速率常數(shù)k分別為0.0 667、0.0 807、0.0 915 min-1和0.0 640、0.0 650、0.0 794 min-1。盡管乳狀液中脂肪在動態(tài)胃腸消化模型中消化初始速率相比靜態(tài)胃腸消化模型較高，但是由于其在動態(tài)胃腸消化模型中的反應(yīng)速率低于靜態(tài)胃腸消化模型，2個模型在最終的游離脂肪酸釋放上差異較小。這可能是由于脂肪消化過程中釋放出來的單甘油酯吸附在油水界面，影響了脂肪酶與底物的作用，從而降低了后期的反應(yīng)速率。

從脂肪酶活性變化對游離脂肪酸最終釋放量的影響可以看出，相對于改變膽鹽濃度，控制脂肪酶的活性是調(diào)控脂肪消化更有效的手段。添加脂肪酶活性的抑制劑可能是改變含乳狀液食品中脂肪消化的有效手段。

2.3 CaCl2對乳狀液中脂肪消化的影響

Ca2+由于可以與游離脂肪酸作用形成溶解度低的脂肪酸鹽，這有利于降低油水界面上脂肪水解生成的游離脂肪酸濃度，因此Ca2+的加入對脂肪酸的釋放有著很大的影響。如圖3所示，由于游離脂肪酸在界面上的吸附不利于脂肪酶的作用，加入一定濃度Ca2+（10、20 mmol/L）提高了乳狀液中脂肪消化程度，游離脂肪酸釋放速率和釋放量都有較大幅度的提高。利用一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt對不同模型中不同CaCl2添加濃度下乳狀液中脂肪消化的曲線進(jìn)行擬合，得到擬合曲線的回歸系數(shù)R2在0.979～0.994范圍，模型可以較好地描述數(shù)據(jù)的變化趨勢。在靜態(tài)胃腸消化模型中，Ca2+濃度為10、20 mmol/L與Ca2+濃度為0時相比，乳狀液中游離脂肪酸前5 min的平均釋放速率分別提高了1.4、4.0倍，游離脂肪酸的總釋放量分別提高了1.0、1.5倍，通過一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt擬合曲線得到的平均反應(yīng)速率常數(shù)分別提高了20.0%、58.6%。在動態(tài)胃腸消化模型中，Ca2+濃度為10、20 mmol/L與Ca2+濃度為0時相比，乳狀液中游離脂肪酸前5 min的平均釋放速率分別提高了1.6、4.1倍，游離脂肪酸的總釋放量分別提高了1.2、1.5倍，通過一級動力學(xué)方程y-y0=ae-kt擬合曲線得到的平均反應(yīng)速率常數(shù)分別提高了44.7%、96.0%。對比不同模型中游離脂肪酸的總釋放量，Ca2+濃度為0、5、10、20 mmol/L時動態(tài)胃腸消化模型比靜態(tài)胃腸消化模型分別增加了18.0%、31.3%、28.1%、18.5%。同時，Ca2+濃度為20 mmol/L 時，乳狀液中脂肪在動態(tài)胃腸消化模型中的釋放量達(dá)到了95.0%。

2.4 消化過程中乳狀液微觀結(jié)構(gòu)變化

為了反映乳狀液在消化過程中的變化，通過顯微鏡觀察了乳狀液在胃腸消化不同時間的微觀結(jié)構(gòu)。不同處理過程中，微觀結(jié)構(gòu)的變化趨勢相同，因此選擇了試驗中1個代表性的消化樣品進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在胃消化過程中，隨著消化的進(jìn)行，乳狀液的穩(wěn)定性有一定變化，乳液顆粒直徑逐漸增大并聚集。盡管胃消化階段無脂肪酶的消化，但是胃消化階段的低酸環(huán)境會降低乳狀液穩(wěn)定性，從而影響其在腸消化階段的消化過程。從胃消化進(jìn)入腸消化階段，在脂肪酶、膽鹽的作用下，乳狀液的顆粒逐漸變大并產(chǎn)生聚合，隨著消化的進(jìn)行，形成形狀不規(guī)則的聚集體，從表觀上表現(xiàn)為消化后期有油滴漂浮在液面上。同時可以看到，在腸消化過程中小顆粒數(shù)量增加，這一過程可能是由于脂肪消化后破壞了乳化劑界面，破壞了乳狀液的穩(wěn)定性，從而產(chǎn)生了乳化顆粒的聚合?？梢姡闋钜旱姆€(wěn)定性與乳化脂肪的消化有一定的關(guān)聯(lián)，提高含乳狀液的食品中乳液的穩(wěn)定性可能可以調(diào)控其脂肪消化。

3 結(jié)論

乳狀液消化試驗的結(jié)果表明，消化條件（脂肪酶和膽鹽）以及外源添加的CaCl2對吐溫20穩(wěn)定的大豆油水包油乳狀液中脂肪消化有明顯影響。乳狀液中脂肪的消化程度與脂肪酶濃度升高呈現(xiàn)正相關(guān)。在一定濃度范圍內(nèi)，膽鹽和Ca2+濃度的提高有利于脂肪的消化。和靜態(tài)胃腸消化模型相比，動態(tài)胃腸模型中脂肪消化的速率和程度都較高。研究表明，調(diào)節(jié)脂肪酶活性和控制外源CaCl2濃度是調(diào)控乳狀液中脂肪消化的有效手段。

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