張耀文，馬文峰，張志丹，劉方圓，王 杰，曹忠洋，王占彬*

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南省飼草飼料資源開發(fā)與畜禽健康養(yǎng)殖院士工作站，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南仰韶生化工程有限公司，河南 三門峽 472400)

抗生素有助于減少傳染病的發(fā)病率和死亡率并提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，所以在醫(yī)療行業(yè)和畜牧業(yè)得到廣泛使用。然而，由于抗生素的濫用導(dǎo)致了細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性以及畜產(chǎn)品中藥物殘留等一系列問題，各個(gè)國(guó)家已開始限制抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的使用，并積極尋找抗生素的替代品?？咕?Antimicrobial peptides, AMPs)是一類多肽物質(zhì)，廣泛存在于自然界的生物中，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和抗炎、抗癌、作為食品防腐劑等功能[1-3]?？咕木哂休^好的水溶性和熱穩(wěn)定性，且不易對(duì)動(dòng)物正常細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[4]，所以適合作為飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用。研究表明，在飼糧中添加抗菌肽能提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，改善其腸道黏膜形態(tài)與功能[5-6]，并提高其成活率，降低腹瀉發(fā)生率[7]，提高肉雞生長(zhǎng)性能，改善腸道黏膜形態(tài)并減少病原菌數(shù)量[8-10]，降低熱應(yīng)激對(duì)雞的不利良影響[11]，提高蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、機(jī)體免疫水平和抗氧化能力，改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)[12-14]。天蠶素抗菌肽是被人發(fā)現(xiàn)的第一種昆蟲抗菌肽，也是現(xiàn)有昆蟲抗菌肽中最受關(guān)注的一種。有研究表明，飼喂天蠶素抗菌肽可提高蛋雞產(chǎn)蛋率[15]，改善肉仔雞腸道黏膜形態(tài)[16]。產(chǎn)蛋后期蛋雞存在著生產(chǎn)性能、免疫力和蛋品質(zhì)量下降及組織器官損傷等問題，故探討飼糧營(yíng)養(yǎng)對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞健康的影響有著較為重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。但至目前有關(guān)天蠶素抗菌肽對(duì)海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能與蛋品質(zhì)影響的研究還尚不多見，有關(guān)其對(duì)海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋后期腸道黏膜形態(tài)影響的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討天蠶素抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及腸道黏膜形態(tài)的作用效果，為其作為新型飼料添加劑的利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

天蠶素抗菌肽由河南省仰韶生化工程有限公司提供，該產(chǎn)品為天蠶素提取物，是抗菌肽粗提品，主要成分為抗菌活性多肽、淀粉等，抗菌肽含量12×104U/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧

選取70周齡產(chǎn)蛋率相近的海蘭褐蛋雞270只。基礎(chǔ)飼糧為參照NRC(1994)營(yíng)養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Ingredients and nutrient composition of the basal diet (air-dry basis)

注：①預(yù)混料為每千克飼糧提供: 維生素A 14 300 IU,維生素D32 700 IU，維生素E 29 IU，維生素K 1.8 mg，維生素B12.25 mg，維生素B28 mg，維生素B61.5 mg，維生素B120.03 mg,煙酸35.75 mg，D-泛酸 7 mg，葉酸 0.5 mg，生物素0.06 mg，氯化膽堿0.47 mg，Ca 15 g，P 5 g， Mn 87.5 mg，F(xiàn)e 100 mg，Cu 5 mg，Zn 75 mg，DL-蛋氨酸0.2%，氯化鈉0.3%。②代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。

Notes:①The Premix provided the following per kg of the diet: VA 14 300 IU, VD32 700 IU，VE 29 IU，VK 1.8 mg，VB12.25 mg，VB28 mg，VB61.5 mg，VB120.03 mg, nicotinic acid 35.75 mg，D-pantothenic acid 7 mg，folic acid 0.5 mg，biotin 0.06 mg，choline chloride 0.47 mg，Ca 15 g，P 5 g，Mn 87.5 mg，F(xiàn)e 100 mg，Cu 5 mg，Zn 75 mg，DL-Met 0.2%，NaCl 0.3%。②ME was calculated, the others were measured.

選取70周齡產(chǎn)蛋率相近的海蘭褐蛋雞270只。參照NRC(1994)蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合海蘭公司推薦飼糧營(yíng)養(yǎng)水平，設(shè)計(jì)玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

采用單因素完全隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將270只產(chǎn)蛋率相近的海蘭褐蛋雞隨機(jī)分為3個(gè)處理(產(chǎn)蛋率依次為：85.83%，85.96%，85.28%)，每處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞，分別為對(duì)照組(基礎(chǔ)飼糧)、試驗(yàn)Ⅰ組(基礎(chǔ)飼糧+50 mg/kg天蠶素抗菌肽)、試驗(yàn)Ⅱ組(基礎(chǔ)飼糧+100 mg/kg天蠶素抗菌肽)，預(yù)飼期7 d，正試期45 d。試驗(yàn)雞采用3層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只雞，自然光照加人工補(bǔ)光，縱向負(fù)壓通風(fēng)，自由采食和飲水。人工喂料與收蛋，每天07:00、14:00、17:30喂料，確保料槽中料量均勻，17:00收蛋。每天觀察雞群健康狀況，記錄死淘雞數(shù)。常規(guī)免疫、消毒和飼養(yǎng)管理。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 試驗(yàn)期間每天以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)、破蛋數(shù)、蛋重，計(jì)算產(chǎn)蛋率、破蛋率與平均日產(chǎn)蛋重。每周以重復(fù)為單位，統(tǒng)計(jì)實(shí)際耗料量，計(jì)算平均日采食量與料蛋比。

1.4.2 蛋品質(zhì) 試驗(yàn)期第45天收集蛋樣，每個(gè)重復(fù)收集10個(gè)蛋，計(jì)算平均蛋重、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋黃相對(duì)重、蛋殼相對(duì)重、蛋白高度、哈氏單位、蛋形指數(shù)、蛋黃膽固醇含量。

蛋重、蛋白高度、哈氏單位：使用英國(guó)TSS蛋品質(zhì)分析儀測(cè)定；蛋殼強(qiáng)度：使用美國(guó)In-spec2200強(qiáng)度測(cè)定儀測(cè)定；蛋形指數(shù)：使用游標(biāo)卡尺測(cè)定雞蛋橫徑長(zhǎng)與縱徑長(zhǎng)并計(jì)算蛋形指數(shù)(縱徑/橫徑)；蛋殼厚度：使用螺旋測(cè)微器測(cè)定(去除內(nèi)外蛋白膜后分別測(cè)量蛋殼銳端、中部、鈍端的厚度，取平均值)；蛋黃膽固醇含量：使用在南京建成生物工程研究所購(gòu)買的總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒按照說明書操作測(cè)定；蛋殼相對(duì)重：蛋殼重/蛋重×100%；蛋黃相對(duì)重：蛋黃重/蛋重×100%。

1.4.3 腸道黏膜形態(tài) 試驗(yàn)雞在屠宰前禁食12 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取1只雞，快速屠宰，分別截取每只雞的十二指腸、空腸和回腸中段2 cm，用4%多聚甲醛固定24 h以上。石蠟包埋后，在切片機(jī)切片，厚4 μm。HE染色，中性樹膠封片。

用顯微鏡觀察，圖像采集分析，選取6個(gè)典型視野，用CaseViewer圖像分析軟件測(cè)量腸絨毛高度(villous height，VH)、黏膜隱窩深度(crypt depth，CD)、腸壁厚度(Intestinal wall thickness)，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件One-Way ANOVA模塊進(jìn)行方差分析，Duncan法多重比較，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，各試驗(yàn)組與對(duì)照組蛋雞的平均日產(chǎn)蛋重、平均日采食量、破蛋率無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組料蛋比顯著降低(P<0.05),產(chǎn)蛋率試驗(yàn)Ⅱ組顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

2.2 抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組的蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位、蛋黃相對(duì)重、蛋殼相對(duì)重與蛋黃膽固醇含量均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞腸道黏膜形態(tài)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組蛋雞十二指腸的絨毛高度、隱窩深度、VH/CD值及腸壁厚度均無顯著差異(P>0.05)。

表2 抗菌肽對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of AMPs on production performance of laying hens

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Values with the same or without superscripts mean insignificant difference (P<0.05), while the different superscripts mean significant difference (P>0.05). The same below.

表3 抗菌肽對(duì)蛋雞蛋品質(zhì)的影響Table 3 Effects of AMPs supplement on egg quality of laying hens

試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組蛋雞空腸絨毛高度、隱窩深度、VH/CD值、腸壁厚度與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組蛋雞回腸絨毛高度顯著提高(P<0.05),VH/CD值無顯著變化(P>0.05)，隱窩深度有提高趨勢(shì)(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組蛋雞回腸腸壁厚度與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)，但試驗(yàn)Ⅰ組顯著低于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

目前有關(guān)天蠶素抗菌肽對(duì)海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能影響的研究尚不多見。有研究表明，在飼糧中添加抗菌肽可顯著提高24周齡海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋率[17]。在380日齡海蘭褐蛋雞飼糧中添加天蠶素抗菌肽可顯著提高產(chǎn)蛋率[15]。在30周齡海塞克斯褐殼蛋雞飼糧中添加抗菌肽粗提物可顯著提高產(chǎn)蛋率[13]。在380日齡海蘭褐蛋雞飼糧中添加鱟素抗菌肽可顯著提高產(chǎn)蛋率和平均蛋重[14]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加不同劑量的天蠶素抗菌肽，對(duì)其平均日采食量與破蛋率無顯著影響，但均可顯著降低其料蛋比。試驗(yàn)Ⅱ組產(chǎn)蛋率顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組與對(duì)照組，并且從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出試驗(yàn)組蛋雞產(chǎn)蛋率與天蠶素抗菌肽添加劑量呈正相關(guān)，因此試驗(yàn)Ⅰ組產(chǎn)蛋率變化不顯著可能是由于天蠶素抗菌肽添加量少的原因。本文研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，可能是由于抗菌肽能加強(qiáng)機(jī)體代謝水平，促進(jìn)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和利用，從而提高生產(chǎn)性能[18]。

表4 抗菌肽對(duì)蛋雞腸道黏膜形態(tài)的影響Table 4 Effects of AMPs supplement on intestinal morphology of laying hens μm

3.2 抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

以往研究報(bào)道表明，飼喂抗菌肽可顯著改善蛋雞蛋殼強(qiáng)度[14-17]。王棚等[12]研究表明，在380日齡海蘭褐蛋雞飼糧中添加抗菌肽Catesbeiania-1可顯著提高蛋殼厚度與蛋殼相對(duì)質(zhì)量。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在蛋雞產(chǎn)蛋后期飼喂天蠶素抗菌肽對(duì)各項(xiàng)蛋品質(zhì)指標(biāo)均無顯著影響，與以上試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是因?yàn)檫x用抗菌肽種類與蛋雞日齡不同有關(guān)，具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 抗菌肽對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞腸道黏膜形態(tài)的影響

小腸絨毛是各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要部位，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要的作用，尤其是小腸絨毛高度、隱窩深度、VH/CD值、腸壁厚度是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。當(dāng)腸絨毛增長(zhǎng)時(shí)，能增加腸黏膜與食糜接觸面積，從而提高小腸消化和吸收能力[19]。隱窩深度能反應(yīng)細(xì)胞的增殖率，隱窩深度變淺說明腸上皮細(xì)胞成熟率上升，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收功能增強(qiáng)。因此VH/CD值可綜合反應(yīng)小腸功能，VH/CD值越高，小腸消化吸收功能越強(qiáng)，VH/CD值減小說明腸黏膜受損，影響小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[20]。腸壁厚度能反應(yīng)腸道組織結(jié)構(gòu)的完整性，特別是腸壁內(nèi)肌層厚度的增加，能使小腸蠕動(dòng)增強(qiáng)，可以提高其消化吸收能力，從而提高生產(chǎn)性能[21-24]。研究表明，飼喂人工合成抗菌肽A3與P5可提高斷奶仔豬十二指腸、空腸絨毛高度與VH/CD值[25-26]，飼喂兔圓小囊抗菌肽可提高1日齡仔公雞十二指腸、空腸絨毛高度[27]，飼喂抗菌肽P5可提高20日齡仔公雞十二指腸、空腸絨毛高度與十二指腸、回腸VH/CD值，并降低空腸隱窩深度[10]，飼喂不同水平天蠶素抗菌肽可提高海蘭褐仔公雞十二指腸、空腸、回腸絨毛高度、黏膜厚度，降低空腸、回腸隱窩深度[28]。本試驗(yàn)研究表明，在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加不同水平天蠶素抗菌肽雖對(duì)其回腸隱窩深度有提高趨勢(shì)，但也顯著提高了回腸絨毛高度。說明在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加天蠶素抗菌肽有利于改善蛋雞腸道黏膜形態(tài)，這可能是由于抗菌肽通過抑菌或殺菌作用，減少有害菌對(duì)腸黏膜的破壞，從而改善腸道黏膜形態(tài)和功能[29]，具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

由此可知，在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加天蠶素抗菌肽可提高其生產(chǎn)性能，改善回腸黏膜形態(tài)。