羅亞軍，林楚霞，文 琳，汪 妍，徐 寧，高建芳

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院,浙江 杭州 311121)

翻譯后修飾(如糖基化、磷酸化、乙?；?是驅(qū)動蛇毒組分及功能多樣化的重要因素[1-3].迄今為止，有關(guān)蛇毒蛋白翻譯后修飾的研究，主要局限于利用特異性顯色劑對修飾類型的表象檢測上，也有部分研究對少量的修飾蛋白進行了質(zhì)譜鑒定[4-11].此外，還有一例研究報道了美洲矛頭蝮(Bothropsjararaca)蛇毒全蛋白組水平的糖基化修飾強度，并預(yù)測了修飾位點[3].少量研究工作報道了翻譯后修飾對蛇毒功能的影響，如從美洲矛頭蝮中分離出的一種具有纖維蛋白原水解活性的絲氨酸蛋白酶(BPA)中，N端糖苷占到總分子質(zhì)量的62%；當局部去除糖基化修飾，發(fā)現(xiàn)其纖維蛋白原水解活性大為增強，且絲氨酸蛋白酶抑制劑也無法再抑制其活性，顯然這種特性受到了聚糖結(jié)構(gòu)的影響[10].對美洲矛頭蝮和銅頭蝮(Agkistrodoncontortrixlaticinctus)蛇毒出血金屬蛋白酶Jararhagin和ACLH去翻譯后修飾處理或直接原核表達的研究發(fā)現(xiàn)，這兩類物質(zhì)與其天然形式相比，出血活性消失，僅保留纖維蛋白原和纖連蛋白水解活性，這種去修飾后組分在臨床抗凝藥物開發(fā)上顯然具有潛在的價值[11].但由于缺少足夠的關(guān)于蛇毒組分翻譯后修飾的表征，限制了翻譯后修飾對蛇毒組分功能影響的研究.

本研究以短尾蝮(Gloydiusbrevicaudus)蛇毒為對象，利用陰離子層析、凝膠排阻色譜和反相高效液相色譜從中分離純化金屬蛋白酶和磷脂酶A2，利用三位點磷酸化修飾抗體檢測兩種組分的磷酸化修飾信號，結(jié)合LC-MS質(zhì)譜鑒定并預(yù)測磷酸化修飾位點.通過位點修飾抗體在短尾蝮蛇毒蛋白磷酸化修飾信號檢測中的實踐，為蛇毒全蛋白組水平的磷酸化修飾研究提供參考，并為特定氨基酸位點的磷酸基團在蛇毒組分功能多樣性變化中的作用研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 蛇毒采集

實驗用短尾蝮成體采自浙江蕭山，用咬膜皿法采集蛇毒，新鮮毒液經(jīng)10 000 r/min 4 ℃離心15 min后吸取上清，隨后用Labconco 4.5 L冷凍干燥機(Labconco)制備成蛇毒凍干粉，并保存于-80 ℃?zhèn)溆?

1.2 蛇毒金屬蛋白酶和磷脂酶A2分離純化

稱取0.3 g蛇毒凍干粉，用20 mmol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液溶解，并用0.22 μm針頭濾器過濾.隨后將過濾液上樣至DEAE Sepharose FF柱(16/10)進行陰離子層析分離，設(shè)置流速2 mL/min，用AKTA-FPLC低壓液相層析系統(tǒng)按以下步驟進行洗脫：20 mmol/L Tris-HCl pH8.0洗脫5個柱體積，0～0.5 mol/L NaCl(含20 mmol/L Tris-HCl pH8.0)線性梯度洗脫30個柱體積，0.5 mol/L NaCl(含20 mmol/L Tris-HCl pH8.0)洗脫5個柱體積，收集各組分峰.取50 mg含目的組分的DEAE Sepharose FF柱分離峰溶于50 mmol/L PBS(含0.15 mol/L NaCl pH7.0)，隨后上樣至Sepharcy S-200 HR柱(Hi Prep 16/60)進行凝膠排阻色譜分離，設(shè)置流速0.2 mL/min，用50 mmol/L PBS(含0.15 mol/L NaCl pH7.0)緩沖液洗脫2個柱體積，收集各組分峰.各組分峰經(jīng)超濾管(3 kDa，Millipore)除鹽濃縮后冷凍干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆?

取1 mg含金屬蛋白酶的凝膠排阻分離峰樣品，溶于含0.1%三氟乙酸(TFA)的超純水，10 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清.將上清上樣至Kromasil 300 C18柱(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)，設(shè)置流速1 mL/min，用Waters E600高效液相系統(tǒng)進行分離.流動相分別為0.1% TFA和乙腈，設(shè)置線性梯度洗脫條件為：含10%乙腈的TFA洗脫10 min，含25%乙腈的TFA洗脫10 min，含45%乙腈的 TFA洗脫45 min，60%乙腈50 min.磷脂酶A2的線性梯度洗脫條件設(shè)置為：含10%乙腈的TFA洗脫10 min，含25%乙腈的TFA洗脫10 min，含35%乙腈的 TFA洗脫50 min.所有組分峰收集后冷凍干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆?

測定各組分峰蛋白濃度時，將其用超純水溶解后以Bradford法測定稀釋液濃度[12]，每個樣品重復(fù)測定3次，以牛血清白蛋白作為標準品.利用各階段收集峰的蛋白含量與上樣蛋白含量的比值作為組分峰的相對含量，以各收集峰總的蛋白含量與上樣蛋白含量的比值計算單次分離的得率.

1.3 蛋白酶水解活性和磷脂酶A2活性檢測

用含2%牛乳酪蛋白的0.2 mol/L Tris-HCl為底物檢測蛇毒金屬蛋白酶水解活性[13]，將陰離子層析或凝膠排阻色譜所得的不同蛇毒組分峰蛋白(40 μg)加入0.5 mL底物液，于37 ℃水浴反應(yīng)2 h.加入等體積0.44 mol/L 三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，隨后5 000 r/min 4 ℃離心15 min取上清.將上清和0.4 mol/L NaCO3以2∶5混合，后加入1份福林酚再次充分混勻，在660 nm下讀取吸光值.蛋白酶水解活性以每分鐘每毫克蛇毒蛋白降解底物引起吸光度改變0.01作為一個酶活性單位(U/(min·mg)).

以大豆卵磷脂為底物檢測磷脂酶A2活性[13]，將陰離子層析或凝膠排阻色譜所得的不同蛇毒組分峰蛋白(0.8 μg)加入200 μL底物體系(0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，7 mmol/L Triton X-100，0.35%大豆卵磷脂和98.8 mmol/L酚紅，pH7.6)，混合均勻后，在室溫靜置觀測1 min，以顏色由淺紫色迅速變?yōu)辄S色作為蛇毒組分是否具有較強的磷脂酶A2活性的判斷標準.

1.4 SDS-PAGE和western blot檢測

各收集峰蛇毒蛋白的SDS-PAGE分離及與磷酸化抗體間的western blot檢測方法參照Gao等[14].蛇毒蛋白定量上樣后用12%分離膠在Bio-Rad Mini Protean III電泳系統(tǒng)分離.電泳結(jié)束后，用半干轉(zhuǎn)印儀將膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(0.45 μm)上，隨后用含5% BSA的TBST緩沖液在4 ℃中封閉過夜.封閉完成后，PVDF膜用TBST緩沖液漂洗3次，隨后將膜轉(zhuǎn)移至小鼠抗Ser/Thr/Tyr三位點磷酸化修飾一抗(1∶1 000稀釋)中，37 ℃搖床孵育1 h.孵育結(jié)束后，PVDF膜用TBST緩沖液漂洗3次，隨后將膜放入HRP標記的兔抗鼠二抗(1∶3 000稀釋)中，37 ℃搖床再次孵育1 h.用TBST徹底洗去膜上未結(jié)合的二抗，并控干PVDF膜上的殘留液.最后用ECL發(fā)光顯色試劑盒對PVDF膜進行連續(xù)曝光顯色，經(jīng)曝光的X光片控干后用Umax2100掃描儀掃描，隨后用Tan4100軟件分析結(jié)果.

1.5 質(zhì)譜鑒定及磷酸化修飾位點預(yù)測

從SDS-PAGE膠上切下目的蛋白條帶，用超純水清洗3次后用槍頭搗碎.加入20 ng/μL胰蛋白酶液40 μL，37 ℃孵育16 h.將酶解液上樣至Zorbax 300SB-C18 peptide traps柱，并經(jīng)Column RP-C18柱(150 mm ×0.15 mm)進行毛細管高效液相分離.以0.1%甲酸水溶液為流動相A液，以含84%乙腈的0.1%甲酸水溶液為流動相B液，設(shè)置線性梯度洗脫條件為：4%～50%B液35 min，50%～100%B液15 min，100%B液5 min.分離產(chǎn)物用Q Exactive質(zhì)譜儀進行鑒定，選擇正離子檢測方式，采集45 min數(shù)據(jù)，每次全掃后采集10個二級質(zhì)譜圖用于分析多肽碎片的質(zhì)荷比.質(zhì)譜結(jié)果用Peaks X搜索引擎在實驗室自有亞洲蝮屬(Gloydius)毒蛇毒腺轉(zhuǎn)錄組翻譯后蛋白庫中進行配對檢索.一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜質(zhì)量容差分別設(shè)置為20 ppm和0.1 Da，允許最大遺漏酶切位點為 1 個，設(shè)置 Carbamidomethyl(C)為固定修飾，Acetyl(N-term)、Oxidation(M)和Phosphorylation(S/T/Y)為可變修飾，設(shè)定肽段得分閾值為15.

2 結(jié)果與分析

短尾蝮蛇毒金屬蛋白酶和磷脂酶A2的分離及活性檢測結(jié)果見圖1、圖2.

A：DEAE-Sepharose陰離子層析；B：Sepharcy-200凝膠排阻色譜；C：C18柱反相高效液相色譜分離蛇毒金屬蛋白酶；

A：DEAE-Sepharose陰離子層析；B：Sepharcy-200凝膠排阻色譜.

A：蛇毒蛋白SDS-PAGE電泳；B：磷酸化修飾抗體；

短尾蝮粗毒經(jīng)DEAE-Sepharose陰離子層析共分離獲得8個組分峰，2、3、4和7號峰蛇毒蛋白能明顯水解酪蛋白，且3號峰的水解能力最強(圖1A、圖2A)，達到6.6 U/mg，預(yù)示該組分峰具有較高的蛇毒金屬蛋白酶含量.3號峰組分在1 min內(nèi)能將含酚紅的大豆卵磷脂底物液由淺紫色迅速變?yōu)辄S色，表明該組分峰還具有較強的磷脂酶A2活性.3號峰經(jīng)Sepharcy-200凝膠排阻色譜進一步分離，共收集7個組分峰，6、7兩個峰回收后得率較低，未用于后續(xù)活性分析，其余5個組分峰中只有1、2兩個峰能有效降解酪蛋白，且2號峰水解能力相對較高，達到8.7 U/mg(圖1B、圖2B)，表明該峰可能具有較高的蛇毒金屬蛋白酶含量.凝膠排阻色譜所得7個峰中，僅5號峰組分在1 min內(nèi)能將含酚紅的大豆卵磷脂底物液由淺紫色迅速變?yōu)辄S色，表明該組分峰還具有較強的磷脂酶A2活性.反相高效液相分離結(jié)果顯示，2、5兩個峰仍具有多個復(fù)雜的組分峰(圖1C、D)，其中兩個主要的組分峰a和b經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶，分子質(zhì)量分別為66和16 kDa(圖3A).

Bradford法測定粗毒蛋白及各組分峰含量顯示，分離用短尾蝮粗毒含蛋白55%，單次陰離子層析所得8個峰的最終得率為粗毒蛋白的82.3%，3號峰含蛋白10.3%.凝膠排阻色譜所得的2號峰和5號峰，分別占上樣蛋白的30.0%和11.9%；反相高效液相分離所得的a和b兩個峰，分別占上樣蛋白的44.3%和47.3%，這兩個峰分別占粗毒總蛋白的1.4%和0.6%.

蛋白免疫印跡檢測顯示，最終分離所得a和b兩個峰的蛇毒蛋白能被三位點(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)磷酸化修飾抗體有效識別，呈現(xiàn)出明顯的磷酸化修飾信號，且a峰所含蛋白條帶的信號更為強烈(圖3B).質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，a峰所含組分為蛇毒金屬蛋白酶，共匹配到12條特征性肽段，且肽段集中在活性結(jié)構(gòu)域；并從4條肽段中預(yù)測到4個氨基酸磷酸化修飾位點，分別為1個絲氨酸和3個蘇氨酸(表1).b峰所含組分為磷脂酶A2，共匹配到22條特征性肽段，該組分屬于D49型磷脂酶A2；僅從1條肽段中預(yù)測到1個酪氨酸磷酸化修飾位點(表1).

表1 短尾蝮蛇毒金屬蛋白酶和磷脂酶A2磷酸化修飾鑒定Tab.1 Identification of phosphorylation modification in metalloproteinase and PLA2 from venom of G. brevicaudus

3 討論

一般認為，磷酸化和糖基化修飾對維持蛇毒蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物活性和免疫原性具有重要作用，對于阻斷獵物體內(nèi)含有的生理抑制劑以便毒蛇捕食、消化獵物同樣具有不可忽視的作用[3].此外，這些修飾對于蛇毒中具有藥用活性的組分參與細胞增殖分化及凋亡、骨架調(diào)控、肌肉收縮和神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放、腫瘤的發(fā)生與浸潤擴散也具有重要的影響.理論上，這些修飾可以通過cDNA序列進行預(yù)測，但對于特定修飾類型的強度和復(fù)雜性(如修飾位點、功能和結(jié)構(gòu)域等)，僅依靠對概念性翻譯的預(yù)測是無法獲得相對準確的信息的，且還容易因cDNA序列預(yù)測所得的修飾位點數(shù)量過多，干擾后續(xù)基于位點修飾前后蛇毒蛋白功能變化的研究.利用特異性熒光染料(如Pro-Q Diamond)可實現(xiàn)對磷酸化修飾蛇毒蛋白的識別[2]，但染料無法實現(xiàn)對修飾蛋白肽段的捕獲，因此無法用于高通量篩選鑒定蛇毒蛋白的磷酸化修飾全組.近年來發(fā)展的以抗磷酸化修飾抗體親和捕獲待檢樣品中的磷酸化修飾肽段及高精度檢測技術(shù)，能在樣品鑒定前進行富集處理，便利了樣品蛋白質(zhì)修飾組學研究，已在大腸桿菌組氨酸磷酸化修飾研究中取得了良好的效果[15].

本研究利用三步法分離純化短尾蝮蛇毒金屬蛋白酶和磷脂酶A2，結(jié)合蛇毒活性檢測和質(zhì)譜鑒定驗證兩種組分.考慮到陰離子層析和凝膠排阻色譜分離階段各組分峰仍可能存在多個蛋白條帶，故以酪蛋白和大豆卵磷脂水解活性用于初步判斷，并選擇活性最高組分峰用于后續(xù)分離.當然，兩種底物水解活性并非是蛇毒金屬蛋白酶和磷脂酶A2的唯一判定標準.質(zhì)譜解析所得組分峰a的肽段主要對應(yīng)于自建庫短尾蝮蛇毒金屬蛋白酶的水解活性結(jié)構(gòu)域，但該組分表觀分子質(zhì)量為68 kDa，符合III型蛇毒金屬蛋白酶的分子質(zhì)量特點，理論上應(yīng)能鑒定到除活性結(jié)構(gòu)域之外的去整合素和半胱氨酸富集區(qū)，有可能是該區(qū)域在質(zhì)譜檢測中未能捕獲到對應(yīng)的母離子.蛇毒磷脂酶A2匹配到的特征性肽段相對較多，因其特征性肽段“CCFVHDCC”中含有天冬氨酸，故屬于D49型磷脂酶A2.

Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種分離組分的顯色強度存在較大差異，除了因分子質(zhì)量不同所致的轉(zhuǎn)膜效率差異外，還可能是由于金屬蛋白酶具有較多的磷酸化修飾位點導(dǎo)致其能結(jié)合更多的磷酸化修飾抗體.以往有關(guān)亞洲蝮屬蛇島蝮(Gloydiusshedaoensis)蛇毒的研究利用質(zhì)譜鑒定了5條可被Pro-Q Diamond染色的蛋白，但僅能預(yù)測到1個磷酸化修飾位點[8]，位點預(yù)測的有效性不高.利用三位點磷酸化修飾抗體可有效檢測短尾蝮蛇毒分離組分受到的修飾強度，加之選擇了亞洲蝮屬毒腺轉(zhuǎn)錄組作為自建庫用于質(zhì)譜峰圖解析，保證了位點預(yù)測的有效性.當前檢測也表明，三位點磷酸化修飾抗體完全可用于親和捕獲短尾蝮蛇毒磷酸化修飾組分，進行修飾組學鑒定.

本研究的結(jié)果證實了三位點磷酸化修飾抗體能有效識別短尾蝮蛇毒金屬蛋白酶和磷脂酶A2，并成功預(yù)測了氨基酸修飾位點，為磷酸化修飾抗體用于高通量鑒定蛇毒蛋白磷酸化修飾全組提供了可行性參考，也為研究磷酸化修飾在蛇毒蛋白功能多樣性變化中的作用奠定了基礎(chǔ).