薛彬華，余維麗，王小蝶，劉 奕

中圖分類號R 34

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號1000-1492(2020)04-0508-05

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是由胰腺的急性炎癥所引發(fā)的一種疾病，其特點(diǎn)是炎癥發(fā)生和胰腺壞死及凋亡[1]。據(jù)報(bào)道[2]，胰腺腺泡細(xì)胞炎癥的發(fā)生、增殖、凋亡均參與AP的發(fā)生發(fā)展。IRF9是干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)中的一員，迄今為止，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了9種IRF：IRF1～9[3]。越來越多的證據(jù)表明IRF在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡和增殖調(diào)控及自穩(wěn)平衡、炎癥反應(yīng)等方面都有著重要的作用[3-6]。IRF參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病，以及腫瘤發(fā)生及心血管疾病等[3-4,7]。干擾素調(diào)節(jié)因子IRF9在AP中的具體機(jī)制目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。該課題旨在研究IRF9基因沉默對雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J凋亡的影響，闡釋IRF9基因在AP發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J購于上海富衡細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM+100 mg/L青霉素+10%胎牛血清，1～2 d傳代。Opti-MEM(x1)和Lipofectamine 2000均購于美國LifeTechnology公司。

1.2 試劑IRF9的siRNA序列及一對陰性對照序列購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；DEME/H培養(yǎng)基、RIPA裂解液、TRIzol試劑、ECL熒光劑(顯影劑)、BCA蛋白濃度試劑盒購于合肥塞維爾生物科技有限公司。PVDF膜購于美國Millipore公司，雨蛙素粉末購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 IRF9-siRNA轉(zhuǎn)染胰腺AR42J細(xì)胞將培養(yǎng)至對數(shù)期的AR42J細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到90%，用PBS洗2次，每孔加入1 500 μl Opti-MEM。將細(xì)胞分組為空白對照組、陰性對照組和IRF9沉默組。使用Lipofectamine 2000進(jìn)行si-RNA轉(zhuǎn)染，24 h后使用雨蛙素誘導(dǎo)。

1.4 qRT-PCR檢測各組AR42J細(xì)胞中IRF9及凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA水平取轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，按照TRIzol試劑操作說明書提取細(xì)胞中總RNA。后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，流程參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。IRF9基因上游引物序列：5′-CTGCTCACCTTCATCTACAACG-3′；下游引物序列：5′-ACTAGGATGCCCCTCTCAA-3′；Caspase 3正義引物：5′-GCGGTATTGAGACAGACAGTGGAAC-3′,反義引物：5′-GCGGTAGAGTAAGCATACAGGAAGTC-3′及Caspase 9正義引物：5′-GGGCTCAGCACACGCATTGG-3′,反義引物：5′-TTCTTAGCAGTCAGGTCGTTCTTCAC-3′；GAPDH基因上游引物序列：5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游引物序列：5′-TGTCATATTTGGCAGGTTT-3′。采用熒光定量PCR擴(kuò)增儀按照以下條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，共40個循環(huán)；95 ℃、1 s，60 ℃、15 s，95 ℃、5 s，反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH基因作為內(nèi)參照，計(jì)算IRF9、Caspase 3及Caspase 9的mRNA相對表達(dá)量。

1.5 Western blot法檢測各組AR42J細(xì)胞中IRF9及凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9蛋白的表達(dá)水平Western blot法檢測各組細(xì)胞中的IRF9、Caspase 3及Caspase 9蛋白的表達(dá)情況。取轉(zhuǎn)染成功的AR42J細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞后，提取各組細(xì)胞的總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，按順序孵育一抗，二抗，用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影檢測蛋白。最后用Image-Proplus圖像處理系統(tǒng)分析并計(jì)算 Western blot灰度值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測各組AR42J細(xì)胞凋亡情況AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測：取轉(zhuǎn)染成功后的AR42J細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，按凋亡試劑盒說明書染色，用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測各組凋亡率，用CytExpert分析軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR結(jié)果雨蛙素誘導(dǎo)前與空白對照組比較，沉默組的IRF9基因的mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.762，P<0.05)，Caspase 3及Caspase 9基因的mRNA表達(dá)水平亦降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.987，F(xiàn)=5.894，P<0.05)；而陰性對照組的IRF9、Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達(dá)水平無明顯差異。 雨蛙素誘導(dǎo)24 h后，各組中的IRF9基因的mRNA水平均較雨蛙素誘導(dǎo)前升高(F=28.250，P<0.05)；凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA的表達(dá)水平亦較誘導(dǎo)前升高(F=6.370，F(xiàn)=6.979，P<0.05)。見圖1～3。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

圖3 雨蛙素(100 nmol/L)誘導(dǎo)及IRF9基因沉默的AR42J細(xì)胞Caspase 9的mRNA表達(dá)的影響

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

2.2 Western blot 結(jié)果① 雨蛙素誘導(dǎo)前，陰性對照組AR42J細(xì)胞內(nèi)的IRF9蛋白的表達(dá)與空白對照組比較無明顯變化。IRF9沉默組AR42J細(xì)胞內(nèi)IRF9蛋白的表達(dá)是降低的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.712，P<0.05)，說明IRF9基因沉默成功，見圖4，5。②雨蛙素誘導(dǎo)24 h后，各組中的IRF9基因的蛋白水平均較雨蛙素誘導(dǎo)前升高(F=5.915，P<0.05)，見圖5。凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9的蛋白的表達(dá)水平較誘導(dǎo)前升高(F=4.315，F(xiàn)=4.924,P<0.05)，見圖6,7。

圖4 Western blot 法檢測雨蛙素(100 nmol/L)誘導(dǎo)及IRF9沉默的AR42J細(xì)胞IRF9、Caspase 3、Caspase 9蛋白的表達(dá)水平

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組

圖5 雨蛙素(100 nmol/L)誘導(dǎo)及IRF9基因沉默的AR42J細(xì)胞IRF9蛋白表達(dá)的影響

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

圖7 雨蛙素(100 nmol/L)誘導(dǎo)及IRF9沉默的AR42J細(xì)胞Caspase 9蛋白表達(dá)的影響

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

2.3 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果雨蛙素誘導(dǎo)前，空白對照組(CON)凋亡率是：10.955±1.386，IRF9-NC-siRNA組(NC)凋亡率是：9.453±0.991，IRF9-siRNA組凋亡率是7.755±0.823， IRF9沉默組AR42J細(xì)胞的凋亡率是降低的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=157.772，P<0.05)。雨蛙素誘導(dǎo)24 h后，對照組(CON+)凋亡率是：19.255±1.362，IRF9-NC-siRNA(NC+)組凋亡率是：17.570±1.600；IRF9-siRNA組凋亡率是15.708±3.074，雨蛙素誘導(dǎo)24 h后IRF9沉默組R42J細(xì)胞的凋亡率亦是下降的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.217，P<0.05)。與空白對照組和陰性對照組比較，IRF9-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后的AR42J細(xì)胞的凋亡率是降低的。

圖8 雨蛙素誘導(dǎo)前各組AR42J細(xì)胞凋亡率比較

圖9 雨蛙素(100 nmol/L)誘導(dǎo)后各組AR42J細(xì)胞凋亡率比較

圖10 雨蛙素(100 nmol/L)誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后各組AR42J細(xì)胞凋亡率

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：IRF9沉默組;與空白對照組比較：*P<0.05；與陰性對照組比較：#P<0.05

3 討論

AP是一種臨床上常見的危重癥，由多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征，病情較重者可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征并可伴有器官功能障礙、代謝性酸中毒、休克等嚴(yán)重后果，其病死率較高，預(yù)后較差[8]。當(dāng)胰腺炎發(fā)生時，胰腺腺泡細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞壞死的數(shù)量增加，細(xì)胞內(nèi)各種酶和細(xì)胞器被釋放，并伴有急性炎癥，導(dǎo)致急性重癥胰腺炎[9]。此外，AP的病理特征涉及腺泡細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等方面。凋亡是細(xì)胞正常的生理過程，包括細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變和相關(guān)基因表達(dá)，從而引起細(xì)胞程序性死亡。Caspase 3是白細(xì)胞介素-1β 轉(zhuǎn)化酶家族成員，是凋亡的執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的通路。在各種刺激因子作用下，死亡受體或細(xì)胞內(nèi)死亡信號被激活，Caspase 3被上游的Caspase 9激活，同時Caspase 7也被激活，形成凋亡復(fù)合體，促使細(xì)胞凋亡。本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默IRF9基因，隨后應(yīng)用雨蛙素誘導(dǎo)建立體外AP模型，通過qRT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測IRF9、凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組AR42J細(xì)胞凋亡情況。本研究結(jié)果表明：與空白對照組比較，沉默組IRF9基因的mRNA及蛋白水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對照組IRF9基因的mRNA及蛋白水平無明顯差異，說明IRF9基因沉默成功。雨蛙素誘導(dǎo)24 h后，各組中的IRF9基因的mRNA及蛋白水平均較雨蛙素誘導(dǎo)前升高；凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表達(dá)水平亦升高，說明AP發(fā)生時IRF9及凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平均上調(diào)，IRF9基因沉默后凋亡相關(guān)基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA及蛋白的表達(dá)水平被抑制；與空白對照組及陰性對照組相比，雨蛙素誘導(dǎo)后IRF9沉默組AR42J細(xì)胞的凋亡率有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明在AP發(fā)生時IRF9基因上調(diào)，凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平升高，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，而IRF9基因沉默能夠降低凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，降低細(xì)胞的凋亡率。本研究提示IRF9可能是AP診斷和治療的一個靶標(biāo)，可能為今后AP的診斷和治療提供了理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。