王建力，暢雪麗，張 煒，郭軍紅

線粒體神經(jīng)胃腸腦肌病(mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy，MNGIE)是一組常染色體隱性遺傳的罕見病，臨床表現(xiàn)包括眼瞼下垂和/或眼外肌麻痹、胃腸蠕動障礙、周圍神經(jīng)病變；肌肉病理檢查可發(fā)現(xiàn)破碎紅纖維(ragged-red fibers，RRFs)和破碎藍(lán)纖維(ragged-blue fibers，RBFs)，頭顱磁共振成像(MRI)可見廣泛的腦白質(zhì)病變[1-3]。目前認(rèn)為其致病基因?yàn)槲挥诔Ｈ旧w22q13.32的TYMP基因，該基因編碼胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)。TYMP基因突變致TP功能異常，使脫氧胸苷和脫氧尿苷大量蓄積于組織器官中，從而導(dǎo)致三磷酸脫氧核苷酸庫(dNTPs)的平衡被破壞，引起病人一系列臨床表現(xiàn)。

RRM2B基因位于常染色體8q22.3，編碼p53-誘導(dǎo)型核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase，RNR)的小亞基(p53inducible small subunit of the ribonucleotide reductase，p53R2)。RNR可以催化核糖核苷酸(nucleoside diphospate，NDP)還原生成相應(yīng)脫氧核糖核苷酸(deoxy-ribonucleotide diphosphate，dNDP)，是體內(nèi)三磷酸脫氧核糖核苷酸(deoxy-nucleoside triphosphate，dNTP)從頭合成的限速酶和關(guān)鍵酶[4]。p53R2對于dNTPs的合成十分重要，對于需要不斷復(fù)制的線粒體脫氧核糖核酸(mitochondrial DNA，mtDNA)更是如此；RRM2B基因突變導(dǎo)致dNTP從頭合成途徑異常，從而導(dǎo)致mtDNA耗竭綜合征(mtDNA-depletion syndromes，MDS)[5]。MDS是一組mtDNA拷貝數(shù)嚴(yán)重減少導(dǎo)致受影響組織和器官的能量生產(chǎn)受損的常染色體隱性遺傳疾病[6]。RRM2B基因突變所致的MDS一般表現(xiàn)為癲癇、肌病、胃腸道功能紊亂、乳酸酸中毒、腎小管腎病，甚至幼年死亡[7]。然而MDS仍有較為輕微的臨床表型報道，病人甚至成年起病，臨床表現(xiàn)為MNGIE[8]。

本研究報道1例臨床主要表現(xiàn)為腦白質(zhì)病變、呼吸衰竭、聽力下降、眼外肌麻痹、腹瀉及惡液質(zhì)的中年女性病人，臨床擬診MNGIE，基因檢測結(jié)果提示RRM2B基因c.420G>C純合突變。

1 方 法

1.1 臨床數(shù)據(jù)收集 超過3位專業(yè)的神經(jīng)科醫(yī)生確定病人臨床表現(xiàn)，收集病人生化指標(biāo)及影像學(xué)結(jié)果；股四頭肌處進(jìn)行肌肉活體組織檢查；留取病人靜脈血，康旭醫(yī)學(xué)檢測中心對37個線粒體基因和185個線粒體相關(guān)核基因進(jìn)行檢測及數(shù)據(jù)分析。

1.2 細(xì)胞模型

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃，5% CO2，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基添加10%胎牛血清培養(yǎng)293T細(xì)胞。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，在不含抗生素的完全培養(yǎng)基中接種細(xì)胞，細(xì)胞密度80%～90%時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 Western Blot試驗(yàn) 裂解液提取細(xì)胞蛋白，12 000 r/min離心10 min，97 ℃加熱10 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移至NC膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，在4 ℃下用p53R2/GAPDH抗體孵育過夜。洗膜后，二抗4 ℃孵育過夜。洗膜并檢測結(jié)合抗體。

1.2.4 mtDNA含量檢測 提取細(xì)胞(5×106)的線粒體DNA，利用分光光度計測定線粒體DNA濃度。

1.3 文獻(xiàn)檢索 根據(jù)關(guān)鍵詞RRM2B、線粒體在PubMed、萬方數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)進(jìn)行檢索。

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①公開發(fā)表的期刊論文、著作、會議論文及摘要、學(xué)位論文；②病人經(jīng)基因檢測發(fā)現(xiàn)明確的RRM2B基因變異；③文獻(xiàn)中給出詳細(xì)的臨床表現(xiàn)，包括病人性別、年齡、臨床表現(xiàn)、各臨床表現(xiàn)出現(xiàn)的時間及生化指標(biāo)和輔助檢查。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①未行基因檢測或經(jīng)基因檢測未能明確致病基因；②未對病人臨床表現(xiàn)進(jìn)行詳細(xì)描述或臨床表現(xiàn)以統(tǒng)計學(xué)形式給出；③重復(fù)發(fā)表的病例；④病人為雜合突變，臨床表現(xiàn)極為輕微或僅在特殊誘因下發(fā)病。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

2.1.1 臨床表現(xiàn) 1例40歲女性病人，由于腹瀉及體重減輕入住我院。病人足月順產(chǎn)，6歲使用慶大霉素后雙耳聽力受損，之后聽力逐漸下降，至37歲聽力完全喪失；7歲時曾診斷為過敏性紫癜(具體不詳)；27歲因外傷行頭顱CT檢查，提示腦白質(zhì)病變；31歲時病人出現(xiàn)進(jìn)行性肢體無力，活動后加重；33歲時因發(fā)熱診斷為慢性腎炎(具體不詳)；37歲開始無明顯誘因出現(xiàn)排便次數(shù)增多，每日4次或5次，成形；37～40歲逐漸出現(xiàn)吞咽困難、眼瞼下垂、視物成雙，體重減輕共25 kg。家族史：祖母與外祖母系同村同姓人家，具體親緣關(guān)系不詳；其父排便次數(shù)多，每日4次或5次，成形；32歲剖宮產(chǎn)一女，其女體健。病人身高158 cm，體重34 kg(體質(zhì)指數(shù)13.62 kg/m2)。神經(jīng)系統(tǒng)查體：高級智能活動正常；雙側(cè)瞳孔等大等圓，直徑約4.0 mm，對光反射存在；雙側(cè)眼瞼下垂，眼球活動差；雙耳聽力完全喪失；屈頸無力，吞咽困難，雙側(cè)軟腭上抬無力，四肢近端肌力差，四肢腱反射減弱；四肢末梢淺感覺減退，余神經(jīng)系統(tǒng)查體大致正常。

2.1.2 生化指標(biāo) 尿糖輕微增高；血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血、肝腎功能、電解質(zhì)、血糖、肌酶、甲狀腺功能、風(fēng)濕系列、血漿乳酸水平大致正常。

2.1.3 影像學(xué)檢查 頭顱MRI提示彌漫腦白質(zhì)病變(見圖1)，磁共振波譜分析(MRS)未見乳酸峰增高。肌電圖及神經(jīng)電圖提示輕度神經(jīng)源性損害。上消化道中消化道造影提示：慢性胃炎、胃下垂；腸功能紊亂(通過過快)；橫結(jié)腸低位。

圖1 頭顱MRI提示腦白質(zhì)病變

2.1.4 肌肉病理檢查 征得病人家屬同意后，對病人進(jìn)行肌肉病理檢查。結(jié)果提示：肌纖維大小重度不等，小圓變肌纖維散在存在，蘇木精-伊紅(HE)及改良格莫瑞三色(MGT)染色可見RRFs；琥珀酸脫氫酶(SDH)染色可見大量RBFs，細(xì)胞色素氧化酶(COX)染色可見部分肌纖維COX酶活性缺失：ATPase染色提示Ⅱ型纖維萎縮；油紅 O 染色液(ORO)染色及過碘酸雪夫氏(PAS)染色未見異常。詳見圖2。

圖2 肌肉病理檢查可見RRFs(×100)

2.1.5 基因檢測 在征得病人家屬同意后對病人進(jìn)行基因檢測。檢測線粒體基因組上的37個基因，未發(fā)現(xiàn)與臨床表型相關(guān)的基因變異，進(jìn)一步檢測未發(fā)現(xiàn)病人線粒體基因大片段變異；檢測線粒體病相關(guān)185個核基因，在病人RRM2B基因發(fā)現(xiàn)c420.G>C(p.Leu140Phe)的純合核苷酸變異，對病人父母該位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測序，證實(shí)其父母該位點(diǎn)均為雜合子(見圖3)。該突變在ExACA、ClinVar及OMIM數(shù)據(jù)庫均未見收錄。

圖3 基因檢測結(jié)果(箭頭指示突變位點(diǎn))

2.1.6 隨訪結(jié)果 2年后，病人因發(fā)熱導(dǎo)致呼吸衰竭再次入住我院。查體：體質(zhì)指數(shù)較前無明顯改變；右側(cè)瞳孔3.5 mm，左側(cè)瞳孔3.0 mm，對光反射消失；其他體征較前無明顯改變。血?dú)夥治?鼻導(dǎo)管吸氧狀態(tài)下)：pH 7.09，動脈血氧分壓103 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，動脈血二氧化碳分壓108 mmHg。立即給予病人抗感染及呼吸支持治療；在院期間反復(fù)發(fā)生嚴(yán)重感染，6個月后病人家屬要求帶管離院(氣管切開狀態(tài))，院外繼續(xù)家用呼吸機(jī)輔助呼吸；規(guī)律隨訪1年后失訪。

2.2 細(xì)胞模型 干擾質(zhì)粒(pLVX-shRNA2-shR RM2B)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞抑制293T細(xì)胞RRM2B基因轉(zhuǎn)錄，之后轉(zhuǎn)染含突變的過表達(dá)質(zhì)粒[Plvx-IRES-ZsGreen1-RRM2B(c.420G>C)]模擬RRM2B基因c.420G>C的突變細(xì)胞。

2.2.1 RRM2B基因c.420G>C突變降低293T細(xì)胞內(nèi)RRM2B基因蛋白表達(dá)水平 RRM2B基因是編碼p53R2蛋白的核基因。Western Blot法測定細(xì)胞內(nèi)p53R2蛋白的數(shù)量(見圖4)，在含突變細(xì)胞內(nèi)p53R2蛋白含量顯著下降，即RRM2B基因蛋白表達(dá)量下降。同時，在轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒(pLVX-res-ZsGreen1-RRM2B)后可以逆轉(zhuǎn)這種下降趨勢。

2.2.2 RRM2B基因c.420G>C突變降低293T細(xì)胞內(nèi)mtDNA含量 p53R2蛋白對于mtDNA的生成十分重要，所以推測RRM2B基因c.420G>C突變同樣可以影響mtDNA數(shù)量并導(dǎo)致MDS。提取細(xì)胞內(nèi)mtDNA，利用分光光度計測定mtDNA含量(見圖5)。在突變細(xì)胞內(nèi)mtDNA數(shù)量顯著下降，同時，在轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒(pLVX-res-ZsGreen1-RRM2B)后mtDNA含量恢復(fù)。

A：空白組，無任何處理；B：干擾質(zhì)粒的空白對照；C：過表達(dá)質(zhì)粒的空白對照；D：實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染含點(diǎn)突變的過表達(dá)質(zhì)粒+干擾質(zhì)粒；E：對照組，轉(zhuǎn)染不含點(diǎn)突變的過表達(dá)質(zhì)粒+干擾質(zhì)粒。與實(shí)驗(yàn)組比較，＊P<0.001。圖4 RRM2B基因c.420G>C下調(diào)基因表達(dá)量

A：空白組，無任何處理；B：干擾質(zhì)粒的空白對照；C：過表達(dá)質(zhì)粒的空白對照；D：實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染含點(diǎn)突變的過表達(dá)質(zhì)粒+干擾質(zhì)粒；E：對照組，轉(zhuǎn)染不含點(diǎn)突變的過表達(dá)質(zhì)粒+干擾質(zhì)粒。與實(shí)驗(yàn)組比較，＊P<0.001。圖5 RRM2B基因c.420G>C降低細(xì)胞內(nèi)mtDNA含量

2.3 文獻(xiàn)回顧 根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，初次檢索后得到76篇文獻(xiàn)；根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)最終得到9篇文獻(xiàn)[7-15]。根據(jù)9篇文獻(xiàn)，統(tǒng)計來自12個家系的13例RRM2B基因變異病人(包含本研究納入的1例病人)的臨床數(shù)據(jù)，總結(jié)RRM2B基因變異的臨床特點(diǎn)。詳見表1。

表1 13例RRM2B基因突變病人臨床表現(xiàn)及輔助化驗(yàn)檢查指標(biāo)

3 討 論

哺乳動物中，mtDNA共編碼13種線粒體蛋白質(zhì)；但是mtDNA的數(shù)量及表達(dá)依賴于數(shù)百個核基因編碼的在細(xì)胞質(zhì)中合成后輸入線粒體的蛋白質(zhì)，這些基因決定了mtDNA的數(shù)量、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA成熟和翻譯[16]。這一類核基因可以分為兩類：一類是編碼的蛋白可以直接作用于mtDNA復(fù)制叉的基因，例如POLG、POLG2和TWINKLE；一類是編碼的蛋白可以為mtDNA復(fù)制提供所需的dNTPs，例如TK2、DGUOK、TYMP、SUCLA2、ANT1[17]。也就是說，這些核基因的變異可以影響線粒體內(nèi)的核苷酸平衡或mtDNA復(fù)制進(jìn)而導(dǎo)致mtDNA異常。

RRM2B基因是編碼p53R2的核基因，位于8q22.3。兩個拷貝數(shù)的p53R2與兩個拷貝數(shù)的R1一起形成RNR；RNR可以催化NDP還原生成相應(yīng)dNDP，為DNA的合成和修復(fù)提供前體[18]。p53R2對于非增殖細(xì)胞中DNA修復(fù)和mtDNA合成所需的dNTPs合成至關(guān)重要[19]。

RRM2B基因變異主要影響的器官是骨骼肌、大腦及腎臟[20]。RRM2B基因變異導(dǎo)致MDS，表現(xiàn)為癲癇、肌張力降低、腹瀉、腎小管病變、乳酸酸中毒和嬰幼兒早期死亡[7]。

缺乏p53R2會阻礙氧化損傷后DNA的修復(fù)并激活p53依賴的細(xì)胞凋亡。由于腎臟對于清除體內(nèi)有毒代謝產(chǎn)物十分重要，意味著腎臟經(jīng)常暴露于各種氧化應(yīng)激環(huán)境下，因此RRM2B突變常導(dǎo)致嚴(yán)重的腎臟損害[21]。RRM2B基因突變所致疾病的臨床表現(xiàn)可能存在組織器官特異性，這可能與胚胎早期細(xì)胞核DNA突變致mtDNA復(fù)制異常，在不同干細(xì)胞之間mtDNA損傷或耗竭的程度不同[22]；隨著干細(xì)胞的分裂分化產(chǎn)生了組織器官特異性，同樣可以解釋不同病人之間發(fā)病年齡、病情嚴(yán)重程度差異較大的原因。本研究所報道的1例病人臨床表現(xiàn)為胃腸道功能紊亂、周圍神經(jīng)損害、RRFs和腦白質(zhì)病變，完全符合MNGIE的臨床特征，基因檢測發(fā)現(xiàn)RRM2B基因c.420G>C純合核苷酸變異。目前已有文獻(xiàn)報道成年RRM2B基因突變病人臨床表現(xiàn)為MNGIE[8]。事實(shí)上，RRM2B基因突變病人臨床常伴隨有胃腸道功能障礙，出現(xiàn)類似MNGIE病人臨床表型，稱為MNGIE-like[23]。

通過對所統(tǒng)計的文獻(xiàn)中13例病人的臨床表現(xiàn)、生化指標(biāo)及輔助檢查結(jié)果總結(jié)：①所有病人均出現(xiàn)不同程度的肌無力，且肌無力出現(xiàn)后常伴隨著病人病情的嚴(yán)重暴發(fā)，提示肌無力出現(xiàn)的早晚可能與病人病程長短呈正相關(guān)，同時提示臨床醫(yī)生在處理該類病人過程中，在出現(xiàn)肌無力的臨床表現(xiàn)后，應(yīng)積極進(jìn)行對癥處理，做好呼吸支持和營養(yǎng)支持，以降低或推遲致死性臨床癥狀的發(fā)生。②有4例(30.8%)病人表現(xiàn)出文獻(xiàn)中RRM2B基因突變所致的典型的腎小管疾病，但在晚發(fā)型病人未見到典型的腎小管病，該4例病人的腹部超聲均表現(xiàn)為腎椎體高回聲影，這可能與鈣沉積相關(guān)。因此臨床兒科醫(yī)生應(yīng)注意完善該類病人的腎臟超聲，一旦發(fā)現(xiàn)腎臟有類似影像學(xué)表現(xiàn)，應(yīng)考慮到RRM2B基因突變的可能性。③有6例(46.2%)病人的頭顱影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)脫髓鞘樣改變，除外7例未進(jìn)行腦脊液檢查的病人，6例行腦脊液檢查的病人中腦脊液蛋白水平均明顯升高，高度提示RRM2B基因突變可破壞血腦屏障；且編號為2、3的病人聽力障礙均為應(yīng)用抗生素藥物后出現(xiàn)，猜測可能是因?yàn)檠X屏障受損導(dǎo)致藥物穿透血腦屏障后作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致藥物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用發(fā)生率增加。因此，對于此類病人應(yīng)謹(jǐn)慎使用中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的藥物，以降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用的發(fā)生的概率。④有7例(53.8%)病人出現(xiàn)不同的胃腸道癥狀(包括食欲差、嘔吐、腹瀉)，其中編號為1、2、3、11的病人同時具備胃腸道癥狀、聽力障礙、眼瞼下垂/眼外肌麻痹，輔助檢查頭顱影像學(xué)檢查異常、肌肉活檢可見RRF等特征，臨床上亦可診斷MNGIE，再次明確RRM2B基因突變可導(dǎo)致MNGIE的臨床表型，擴(kuò)充了MNGIE的基因譜。⑤在5例仍存活的病人中，包括2例臨床表現(xiàn)嚴(yán)重的早發(fā)型病人，此2例病人在病程前期即給予G-管進(jìn)行營養(yǎng)支持；2例呼吸肌輔助呼吸的病人在院外繼續(xù)呼吸機(jī)輔助呼吸后仍可較長時間存活，提示對于此類病人，較早的進(jìn)行營養(yǎng)學(xué)支持和必要的呼吸支持能顯著改善病人預(yù)后。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染pLVX-shRNA2-shRRM2B至293T細(xì)胞抑制細(xì)胞內(nèi)RRM2B基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染Plvx-IRES-ZsGreen1-RRM2B(c.420G>C)模擬突變細(xì)胞，作為對照組轉(zhuǎn)染pLVX-res-ZsGreen1-RRM2B挽救實(shí)驗(yàn)組的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與對照組相比，含RRM2B基因c.420G>C的細(xì)胞RRM2B基因蛋白表達(dá)量顯著下降，mtDNA含量下降，初步明確了該突變的致病性和致病機(jī)制。

在RRM2B基因變異的病人中：①肌無力的發(fā)生常意味著致死性臨床癥狀的發(fā)生；②MNGIE的臨床表型常見；③早期營養(yǎng)支持以及及時的呼吸支持可能會顯著改善病人預(yù)后。