通痹方熱奄包外敷對家兔退變頸椎間盤細胞凋亡相關基因Caspase-3和Bcl-2 mRNA的影響*

徐銀琴，王光義*

(貴州醫(yī)科大學附院 針灸科，貴州 貴陽 550004)

椎間盤退變被認為是引起頸、腰椎病疼痛的主要原因，而頸腰痛是目前臨床最常見的頸椎病和腰椎病的就診原因，每年醫(yī)療費用巨大[1]。椎間盤退變是由衰老、異常應力、損傷等多種因素引起的椎間盤慢性退行性病變，其病理過程往往伴隨著細胞減少、細胞外基質丟失、Ⅰ型膠原大量合成等，最終導致椎間盤結構和功能發(fā)生改變[2]。有研究指出，椎間盤細胞過度凋亡導致的細胞數(shù)量減少和細胞活力喪失可直接影響椎間盤的功能[3]。因此，能否有效抑制椎間盤細胞凋亡、改善椎間盤功能成為臨床治療椎間盤退行性疾病新的攻破點。中藥熱奄包作為一種中醫(yī)保守療法，藥物在熱力作用下可直接滲透至病灶深部，有疏通經(jīng)絡、活血化瘀、緩解疼痛及減輕炎癥的作用[4]。天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific protease-3，caspase-3)是半胱氨酸蛋白酶家族的成員，與細胞凋亡有著密不可分的關系，可通過降解細胞內(nèi)底物激活細胞凋亡通路，致使細胞凋亡[5]。B淋巴細胞瘤-2(B lymphocytoma-2，Bcl-2)是Bcl-2家族主要的抗凋亡蛋白，可抑制細胞色素C釋放, 阻止下游胱冬肽酶的激活, 從而起到抑制凋亡發(fā)生的作用[6]。因此，本研究通過建立新西蘭大白兔頸椎間盤退變模型，探討中藥熱奄包外敷療法對退變椎間盤細胞凋亡相關基因Caspase-3和Bcl-2 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥品、試劑及儀器

1.1.1實驗動物 普通級新西蘭大白兔[SYXK(黔)2018-0001]18只，雌雄各半，每只體質量2.0～2.5 Kg，貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要藥品與試劑 通痹方(葛根20 g、桂枝12 g、伸筋草10 g、牛膝10 g、路路通10 g、細辛10 g、防風10 g、川芎15 g、紅花10 g、沒藥20 g、赤芍15 g、獨活15 g、威靈仙15 g及秦艽15 g)為貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院針灸科自制方，中藥材均購自貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院；TRIZOL試劑盒和熒光定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色液購自湖南艾佳生物有限公司，引物由中國生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.3主要儀器 1730R高速冷凍離心機(香港基因有限公司)、YB-6LF生物組織石蠟包埋機(孝感亞光醫(yī)用技術有限公司)、YT-6C生物組織攤烤片機(孝感亞光醫(yī)用技術有限公司)、AE41光學顯微鏡(廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司)和7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 18只家兔適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為空白組、模型組及熱敷組，每組各6只。模型組和熱敷組家兔采用長期低頭位建模法建立頸椎病家兔模型[7]，即將家兔置于兔固定盒內(nèi)，充分顯露頸部，敷以保濕冰袋，使其頸部成低頭屈曲位45°、3 h/次、2次/d，造模30 d后拍攝頸椎X線片，見家兔頸椎出現(xiàn)生理曲度改變、反弓或椎間隙變窄、椎間孔變小、椎體出現(xiàn)骨質增生或椎體周圍軟組織鈣化等變化中的2項時即視為造模成功?？瞻捉M同期正常飼養(yǎng)，不做任何干預；模型組僅作造模處理，不予任何治療；熱敷組造模成功后用通痹方方藥制成熱奄包，加水煎熬后去除藥包多余水分，將溫度適宜的熱奄包置于家兔頸部進行熱敷，1次/d、15 min/次，治療5次，休息2 d，共治療15次。

1.2.2頸椎影像學觀察及評分 各組家兔在造模前、造模第30天及治療結束后拍攝頸椎左側位X線，觀察頸椎病變情況，并參照文獻[8]方法以造模前X線檢查作參照，于造模第30天、治療結束后2個時間節(jié)點對頸椎椎間隙、椎體前后緣、頸椎上下關節(jié)突骨質增生情況、椎間孔、頸椎生理曲度進行評分，并計算治療后X線積分改善程度(治療后X線積分改善程度=造模后X線積分-治療后X線積分)。

1.2.3頸椎間盤組織形態(tài)學觀察及評分 于治療結束后第2天取出各組家兔C3-4椎間盤在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，4 ℃冰箱過夜，0.9%生理鹽水浸洗2～3次，置于10%EDTANa2溶液脫鈣，經(jīng)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色液染色，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化，參照文獻[9]方法對椎間盤組織形態(tài)進行評分，評分范圍從正常椎間盤4分到嚴重退變椎間盤12分。

1.2.4椎間盤Caspase-3和Bcl-2 mRNA 采用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(Real-time Quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測。取各組家兔C4-5椎間盤液氮研磨后用Trizol法提取總RNA，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR反應，反應體系為10 μL:SYBR Mix 5 μL，引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反應參數(shù)為50 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔCt法計算Caspase-3和Bcl-2 mRNA的相對表達量。見表1。

表1 相關引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 頸椎X線評分

與空白組相比，模型組和熱敷組家兔造模后頸椎X線評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；熱敷組家兔治療后頸椎X線積分改善程度較模型組大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組家兔頸椎X線評分和積分改善程度比較Tab.2 The effect of tongbi hot compress on X-ray imaging scores and score improvement of rabbits' cervical spine in the different

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.2 C3-4椎間盤組織結構

HE染色結果顯示，空白組家兔C3-4椎間盤纖維環(huán)層次分明、排列整齊、結構正常、細胞分布均勻，模型組家兔椎間盤纖維環(huán)可見纖維排列松散紊亂、出現(xiàn)較多撕裂和細胞腫脹變性，熱敷組家兔椎間盤纖維環(huán)排列相對整齊、層次相對清楚和細胞形態(tài)稍好；模型組家兔椎間盤評分比空白組升高，熱敷組評分比模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖1 各組家兔C3-4椎間盤纖維環(huán)組織學及HE染色評分Fig.1 The effect of tongbi hot compress on histology of C3-4 intervertebral disc annulus in the different groups

2.3 C4-5椎間盤Caspase-3和Bcl-2 mRNA的相對表達量

與空白組相比，模型組家兔C4-5椎間盤內(nèi)Casepase-3 mRNA表達升高、Bcl-2 mRNA表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，熱敷組家兔椎間盤內(nèi)Casepase-3 mRNA表達降低，Bcl-2 mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組家兔椎間盤Caspase-3和Bcl-2 mRNA相對表達量比Tab.3 The effect of tongbi hot compress on Caspase-3 and Bcl-2 mRNA in C4-5 intervertebral discs in the different groups

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

3 討論

椎間盤由中心的髓核、包裹于髓核周圍的纖維環(huán)以及上下端的軟骨終板構成[10]，位于上下兩椎體之間，起到緩沖震蕩、均勻分散脊柱應力、連接椎體及維持脊柱高度的作用，是人體最容易發(fā)生退變的組織[11]。導致椎間盤發(fā)生退變的因素眾多，常見的有機械壓力、創(chuàng)傷、免疫因素以及缺血缺氧等均可誘使椎間盤過早的發(fā)生退變[12]。本研究使用低頭位造模法經(jīng)長時間誘導之后建立家兔頸椎間盤退變模型，較好的模擬人類長期低頭頸椎異常應力所致頸椎間盤退變，且兔頸椎結構與人類頸椎結構極為相似，這使得研究所用模型更符合臨床實際。建立模型后，本研究觀察到家兔頸椎X線出現(xiàn)了不同程度的椎間隙狹窄、曲度變直，椎體邊緣觀察到骨贅形成，小關節(jié)出現(xiàn)增生硬化等情況，說明模型建立成功。在對家兔頸椎X線的評分中，與空白組相比，模型組和熱敷組家兔造模后頸椎X線評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；熱敷組家兔治療后頸椎X線積分改善程度較模型組大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；椎間盤HE染色顯示，空白組家兔椎間盤纖維環(huán)層次分明、排列整齊、結構正常、細胞分布均勻，模型組家兔椎間盤纖維環(huán)可見纖維排列松散紊亂，出現(xiàn)較多撕裂和細胞腫脹變性，熱敷組家兔椎間盤纖維環(huán)排列相對整齊、層次相對清楚和細胞形態(tài)稍好；模型組家兔椎間盤評分比空白組升高，熱敷組評分比模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這些結果提示建模過程中家兔的不當體位以及異常應力致使家兔頸椎椎間盤發(fā)生退變，經(jīng)過通痹方外敷治療后從影像學上家兔頸椎整體退變情況較前好轉，從組織形態(tài)學上椎間盤退變程度也較治療前減輕。

細胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細胞自主性死亡，存在于機體的整個生命過程維持機體器官或組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]，對機體的免疫和防御反應、疾病或中毒引起的細胞損傷等都具有非常重要的作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡異常與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展密切相關，細胞凋亡異常增多導致椎間盤細胞活性降低、活性細胞數(shù)量減少，加重了椎間盤退變過程[15]。研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞凋亡異常增加, 會導致椎間盤內(nèi)的活化軟骨細胞數(shù)量減少, 軟骨細胞合成和(或)降解細胞外基質的能力降低,致使代謝產(chǎn)物堆積于椎間盤內(nèi),營養(yǎng)物質的供應減少,最終導致椎間盤發(fā)生退變[16]。同樣有很多研究者認為，細胞凋亡過度或衰老會引起的椎間盤髓核細胞數(shù)目減少和細胞活性降低，細胞外基質合成減少而分解增加是導致椎間盤退變的主要原因[17]。也有研究認為細胞凋亡導致的纖維環(huán)細胞減少是纖維環(huán)退變的主要原因，而椎間盤纖維環(huán)細胞減少，細胞外基質成分也不斷減少，進而導致椎間盤發(fā)生退變[18]?？偠灾?，細胞凋亡是椎間盤退變的重要環(huán)節(jié)，椎間盤細胞過度凋亡后導致的細胞數(shù)量減少、細胞活性降低以及細胞外基質成分合成減少，是促進椎間盤退變和衰老主要因素。Caspase級聯(lián)反應是細胞凋亡通路的中心環(huán)節(jié)，Caspase-3作為Caspase級聯(lián)反應下游最關鍵的凋亡蛋白酶，在死亡受體途徑與線粒體凋亡途徑等途徑中介導了細胞凋亡[5]。在正常情況下, 胞質中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，細胞發(fā)生凋亡時被釋放到細胞質中的細胞色素C激活天冬氨酸特異性蛋白酶-9(cysteine-containing aspartate-specific protease-9，Caspase-9)，繼而激活Caspase-3[19]；被活化后的Caspase-3直接參與切割或降解細胞的多種結構和功能蛋白，引起細胞功能障礙、細胞凋亡[20]。對人退變腰椎間盤的研究表明，腰椎間盤退行性病變患者血清中Caspase-3和Caspase-9的濃度明顯高于正常健康者，而且Caspase-3、Caspase-9的濃度與腰椎間盤突出節(jié)段的數(shù)量有直接聯(lián)系，指出凋亡因子Caspase-3和Caspase-9腰椎間盤退變的發(fā)生或發(fā)展過程中起到重要作用[21]。在線粒體凋亡通路上Bcl-2家族是細胞凋亡的調(diào)控者，以線粒體為調(diào)控凋亡單位，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bcl-2家族蛋白Bax為促凋亡蛋白，當Bcl-2表達降低、Bax表達升高時，線粒體通道開放釋放出細胞色素C等誘導凋亡因子啟動下游凋亡發(fā)生[22]。Bcl-2是線粒體凋亡途徑上最重要的抗凋亡因子，通過減少凋亡誘導因子、與促凋亡因子Bax 結合、拮抗凋亡蛋白酶等發(fā)揮抑制凋亡作用[23]。有研究報道，Bcl-2可抑制線粒體中內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶及細胞色素C的釋放，干預Caspase-3活化進而發(fā)揮抗凋亡的作用，認為Bcl-2可能抑制了Caspase-3 的合成[6]。有人在對人類退變椎間盤的研究中發(fā)現(xiàn)，在椎間盤退行性變程度逐漸加重的過程中，髓核組織中的Bax和Casepase-3表達量也呈現(xiàn)出增長趨勢，Bcl-2則趨于下降[24]，這說明椎間盤退行性變程度越重，髓核細胞的凋亡水平越高。周文明等[10]用補腎壯督方對椎間盤退變模型大鼠干預后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干預后大鼠退變椎間盤中活化Caspase-3表達量明顯下降，Bcl-2表達量明顯增加。同以上研究結果一致，本次研究結果顯示：與空白組相比，模型組家兔椎間盤內(nèi)Casepase-3 mRNA表達升高、Bcl-2 mRNA表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，熱敷組Casepase-3 mRNA表達較模型組降低，Bcl-2 mRNA表達較模型組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示造模后家兔退變頸椎間盤內(nèi)細胞凋亡增多，而在治療后，與模型組相比較，熱敷組Casepase-3表達降低、Bcl-2表達升高則說明經(jīng)通痹方熱奄包外敷治療后椎間盤內(nèi)細胞凋亡較前減少。

在既往的研究中研究者用中藥熱奄包對腰椎間盤突出癥患者進行熱敷治療后，患者腰骶部疼痛及下肢麻木癥狀明顯緩解[25]。有臨床研究采用中藥熱奄包聯(lián)合手法治療腰椎間盤突出癥患者總有效率達92.5%，VAS評分較治療前顯著降低[4]。本研究所用通痹方為自擬方，在臨床應用10余年，口諭頗佳。全方以紅花、赤芍、獨活、威靈仙、防風、細辛等祛風除濕、舒筋通絡、活血止痛為主，輔以川芎、桂枝、葛根溫通經(jīng)脈、通達氣血，全方合用具有溫經(jīng)通絡止痛、調(diào)和氣血、祛濕除寒的作用，主要治療以頸椎病、腰椎病、風濕性關節(jié)炎等為主的痹證[26]。用此方制成熱奄包對疼痛局部進行熱敷可使藥效滲透到病變局部，起到溫經(jīng)散寒、活血通絡止痛的作用，且溫熱的藥物直接作用于局部可促進經(jīng)脈氣血運行、扶正祛邪，能有效改善患者局部畏寒、疼痛不適等情況。

綜上所述，通痹方熱奄包外敷治療可導致抗凋亡因子Bcl-2表達上調(diào)和凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的表達下調(diào)，從而減少椎間盤細胞凋亡，改善椎間盤退變程度。