崔方強 王悅芬 高彥彬 江心燦 趙文景

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京 100010)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是臨床常見的糖尿病并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年升高，已經成為終末期腎病的主要原因[1]。DN的發(fā)病機制十分復雜，至今尚未完全闡明，有研究認為腎小球系膜細胞過度增殖及細胞外基質增生是DN早期特征性的病理改變[2]。而系膜細胞外泌體miR-192在系膜細胞肥大及細胞外基質增生方面發(fā)揮著重要作用[3]，還會通過自分泌或旁分泌途徑影響系膜細胞及足細胞，進而介導系膜細胞及足細胞損傷[4]。因此，系膜細胞外泌體miR-192水平異常被認為是導致DN進展的重要病理機制。保腎通絡方是我們臨床治療DN的經驗方，臨床研究已經證實其對DN具有很好的治療效果，可明顯降低患者蛋白尿水平，改善腎功能[5]。同時，前期實驗研究也證實，保腎通絡方可以有效減輕DN小鼠足細胞損傷，改善腎臟病理表現[6]。為進一步探討保腎通絡方治療DN的作用機制，我們擬通過觀察其對高糖培養(yǎng)下腎小球系膜細胞基質增生及外泌體miR-192表達的影響，結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠20只，8周齡，體質量(203.28±14.67)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.1.2 實驗細胞 永生化小鼠腎小球系膜細胞，由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供，批號：SV40 MES 13。

1.2 實驗藥物 保腎通絡方顆粒劑，主要由黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭及丹參組成，由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備，每1 g顆粒劑含4.01 g生藥。

1.3 主要試劑及儀器 小鼠膠原蛋白Ⅳ(Collagen Ⅳ)抗體、纖維連接蛋白(FN)抗體(英國Abcam公司)；細胞增殖活性檢測CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；外泌體提取試劑盒(美國System Biosciences公司)；Trizol總RNA抽提試劑盒 (美國Invitrogen公司)；M-MLV逆轉錄酶[寶生物工程(大連)有限公司]；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；3K18高速離心機(德國Sigma公司)；ZS-3板式酶標儀(北京市新風機電技術公司)；Fusion FX6-XT凝膠化學發(fā)光成像分析系統(法國Vilber公司)；迷你雙垂直電泳槽、迷你轉印電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；PRISM 7700實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)儀(美國ABI公司)；倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 含藥血清制備 將20只SD大鼠隨機分為正常對照組、保腎通絡方低劑量組、保腎通絡方中劑量組及保腎通絡方高劑量組，每組5只。保腎通絡方低、中、高劑量組大鼠分別予濃度為0.5、1.0、2.0 g/mL的保腎通絡方顆粒劑藥液灌胃，每次灌胃2 mL，每日2次。正常對照組大鼠予等容積蒸餾水灌胃。各組大鼠連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃后1 h待血藥濃度穩(wěn)定后，通過腹主動脈取血，分離血清，然后將血清56 ℃水浴30 min，最后采用無菌濾器過濾除菌，-80 ℃保存。

1.5 細胞分組及給藥方法

1.5.1 細胞分組 將永生化小鼠腎小球系膜細胞分為正常對照組、高糖對照組、保腎通絡方低劑量組、保腎通絡方中劑量組及保腎通絡方高劑量組。

1.5.2 給藥方法 將腎小球系膜細胞放入恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)(37 ℃，5%二氧化碳)，待其生長至80%融合并且生長狀態(tài)良好時，進行干預給藥。正常對照組細胞予DMEM低糖培養(yǎng)基+正常對照組大鼠血清培養(yǎng)，高糖對照組細胞予含30 mmol/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基+正常對照組大鼠血清培養(yǎng)，保腎通絡方低、中、高劑量組細胞分別予高糖培養(yǎng)基+10%的保腎通絡方低、中、高劑量含藥血清培養(yǎng)。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 細胞增殖活性CCK-8檢測 首先按照1.5.1中的細胞分組方法將永生化小鼠腎小球系膜細胞分為5組，并制成細胞懸液種植于96孔板中，每組設3個復孔，并設空白對照組，保證每孔的細胞數目一致。然后按1.5.2給藥方法分別對5組細胞進行干預培養(yǎng)，空白對照組只加等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后對各組細胞進行增殖活性CCK-8檢測。向每個孔板加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃下孵育2 h，然后將96孔板放入酶標儀內，在540 nm條件下檢測各組光密度(OD)值，并對細胞增殖活性進行比較。細胞增殖活性=(加藥細胞OD值/空白對照組細胞OD值)×100%。

1.6.2 免疫熒光檢測 首先按照1.5.1中的細胞分組方法將永生化小鼠腎小球系膜細胞分為5組，將消毒好的玻片放入12孔板，每組設3個復孔，然后將各組細胞分別種植于玻片，保證每孔的細胞數目一致。然后按1.5.2給藥方法分別對5組細胞進行干預培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后對各組細胞外基質蛋白Collagen Ⅳ及FN表達情況進行免疫熒光檢測。加入4%多聚甲醛進行固定，透膜后，加入一定濃度的一抗(Collagen Ⅳ 1∶500，FN 1∶500)，4 ℃孵育過夜，然后加入相應的二抗，37 ℃孵育2 h，DAPI細胞核染色后，甘油封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察Collagen Ⅳ及FN表達情況，每組隨機選取15個視野，采用配套的圖像處理軟件計算熒光強度，并對灰度值進行比較。

1.6.3 Real-time PCR檢測 先按照1.5.1細胞分組方法將永生化小鼠腎小球系膜細胞分為5組，然后按1.5.2給藥方法分別對5組細胞進行常規(guī)干預培養(yǎng)，每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h后對各組細胞Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達情況進行檢測。首先將細胞培養(yǎng)液進行收集，離心機3 000 r/min離心15 min，去除細胞和細胞碎片，將上清液移入10 mL無菌離心管，在上清液中加入適量的外泌體提取試劑，混勻后4 ℃過夜(至少12 h)，在1 500 r/min離心30 min，并吸出上清液，然后用1 500 r/min離心法將沉淀離心5 min，吸棄上清液，沉淀即為外泌體。然后對腎小球系膜細胞及收集的外泌體總RNA進行提取，向樣本中加入5 mL的Trizol，室溫放置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，震蕩混勻，保存5～10 min，離心后取出最上層，依次加入預冷異丙醇、75%焦碳酸二乙酯(DEPC)乙醇，離心后，去除乙醇，加入DEPC處理過的水溶解沉淀。最后用反轉錄試劑盒將mRNA轉錄為cDNA，Real-time PCR儀進行擴增及熒光定量。β-actin為內參基因。采用 2-△△CT法進行Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192 mRNA表達的相對定量分析。每個基因重復3次，利用Primer 5.0軟件設計引物序列，見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組小鼠腎小球系膜細胞增殖活性比較 見表2。

組 別n細胞增殖活性(%)正常對照組3100.00±2.02高糖對照組3210.87±21.29?保腎通絡方低劑量組3164.28±19.76△保腎通絡方中劑量組3152.39±13.28△保腎通絡方高劑量組3139.87±14.95△

與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，△P<0.05

由表2可見，與正常對照組比較，高糖對照組細胞增殖活性升高，比較差異有統計學意義(P<0.05)。與高糖對照組比較，保腎通絡方低、中、高劑量組細胞增殖活性均降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。保腎通絡方低、中、高劑量組組間細胞增殖活性比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠腎小球系膜細胞Collagen Ⅳ及FN表達的灰度值比較 見表3。

由表3可見，與正常對照組比較，高糖對照組Collagen Ⅳ及FN灰度值均升高，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與高糖對照組比較，保腎通絡方低、中、高劑量組Collagen Ⅳ及FN灰度值均降低，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。保腎通絡方低、中、高劑量組組間Collagen Ⅳ及FN灰度值比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

組 別nCollagen Ⅳ灰度值FN灰度值正常對照組1560.12±12.4363.34±16.45高糖對照組152 143.87±24.59?265.43±26.42?保腎通絡方低劑量組15154.39±20.17△178.67±19.74△保腎通絡方中劑量組15132.99±21.38△154.84±22.37△保腎通絡方高劑量組15112.63±19.07△138.79±21.05△

與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，△P<0.05

2.3 各組小鼠腎小球系膜細胞Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達水平比較 見表4。

組 別nCollagen Ⅳ mRNAFN mRNAmiR-192 mRNA正常對照組151.00±0.011.00±0.021.00±0.01高糖對照組152.03±0.16?1.89±0.19?1.97±0.14?保腎通絡方低劑量組151.52±0.23△1.46±0.21△1.46±0.22△保腎通絡方中劑量組151.34±0.18△1.36±0.16△1.33±0.17△保腎通絡方高劑量組151.24±0.15△1.23±0.18△1.26±0.13△

與正常對照組比較，*P<0.05；與高糖對照組比較，△P<0.05

由表4可見，與正常對照組比較，高糖對照組Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達均上調，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與高糖對照組比較，保腎通絡方低、中、高劑量組Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達均下調，比較差異均有統計學意義(P<0.05)。保腎通絡方低、中、高劑量組組間Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，DN的發(fā)病率也逐年增加，且DN的病情發(fā)展往往非常迅速，患者一旦出現腎功能異常，將會很快進入終末期腎病階段，對患者的生命健康造成嚴重威脅[7-8]。DN早期的病理改變主要為腎小球肥大、系膜細胞增殖、細胞外基質增生及基底膜增厚等。臨床治療主要以積極控制血糖、血壓，早期使用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體拮抗劑(ARB)類藥物為主，但并不能完全阻斷疾病的進展[9]。研究表明，高血糖可刺激并介導腎小球系膜細胞的活化，促使系膜細胞分泌細胞外基質增多，這也是DN蛋白尿產生及腎小球硬化的重要病理機制[10-11]。Collagen Ⅳ及FN是細胞外基質中的主要成分。Collagen Ⅳ是一種基膜膠原，是腎小球細胞外基質的主要成分，并在系膜細胞間相互交叉呈網狀結構[12]。FN作為一種大分子糖蛋白，在細胞外基質中相互交叉，形成網絡，可為其他細胞外基質成分沉積提供支架[13]。Collagen Ⅳ及FN水平升高，可明顯促進腎組織纖維化[14]。外泌體是一種機體細胞分泌的具有脂質雙層膜的微小膜泡，其作為細胞間通訊的媒介，在細胞穩(wěn)態(tài)、生理學和病理生物學等許多方面都發(fā)揮著至關重要的作用[15]。有研究表明，DN腎小球系膜細胞外泌體miR-192的表達明顯上調，而系膜細胞異常分泌的外泌體可以進入足細胞并引起足細胞損傷。因此，外泌體miR-192表達異常，進而介導系膜細胞活化及足細胞損傷也可能是DN重要的病理機制，而抑制系膜細胞活化，并調控外泌體miR-192的表達可有效延緩DN病情進展[16-17]。本研究結果也顯示，與正常對照組比較，高糖對照組采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后系膜細胞增殖活性明顯升高(P<0.05)，Collagen Ⅳ及FN的表達均明顯增多(P<0.05)，Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達水平均明顯上調(P<0.05)。

DN屬于中醫(yī)學水腫、尿濁、關格等范疇，為本虛標實之證，不同的醫(yī)家對DN的病因病機進行了不同的闡述。呂仁和等[18]認為，DN主要是由于消渴治不得法，傷陰耗氣，痰濁瘀血互相膠結，積聚于腎絡，形成微型癥瘕導致，并提出了“微型癥瘕”的病機學說。南征教授則認為，消渴病久者，必然本體大傷，久病致絡病瘀血，血瘀痰生，熱結毒生，毒傷腎絡，腎絡瘀塞，不能蒸化水液，水液潴留，進一步發(fā)展為DN，并提出了“毒損腎絡”的病機學說[19]。我們認為，DN初期多為氣陰兩虛，陰虛燥熱，繼而出現氣血凝滯，絡脈閉阻，日久耗傷腎之氣精，導致腎失封藏，精微下泄，“腎氣不足，腎精虧虛，腎失封藏，腎絡閉阻”是DN發(fā)病的核心病機，治宜補腎活血通絡。保腎通絡方方中熟地黃補腎填精；黃芪健脾益氣；菟絲子滋補肝腎，固精縮尿；劉寄奴、鬼箭羽活血祛瘀通經；丹參祛瘀生新，活血調經；水蛭破血利水，達到血行則水行之效。諸藥合用，共奏益腎填精、活血通絡之功。本研究結果顯示，與高糖對照組比較，保腎通絡方低、中、高劑量組含藥血清細胞增殖活性明顯受到了一定程度的抑制，均明顯降低(P<0.05)，Collagen Ⅳ及FN的表達均明顯減少(P<0.05)，Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192的mRNA表達水平均明顯下調(P<0.05)，但保腎通絡方不同劑量組組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

前期研究表明保通絡方對DN模型小鼠足細胞有保護作用[6]，并能有效阻止蛋白尿的發(fā)生，延緩疾病進展[20]。本研究結果表明，保腎通絡方還可以降低DN腎小球系膜細胞增殖活性，抑制細胞外基質增生，減少Collagen Ⅳ及FN蛋白的表達，并且能夠下調Collagen Ⅳ、FN及外泌體miR-192 mRNA的表達，從多途徑對DN進行干預治療。綜上所述，保腎通絡方對DN的防治具有多靶點效應。