吳彪 賀奕森 付文博 郝光飛河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 河北 邯鄲 056000

多不飽和脂肪酸，特別是ARA對(duì)人類的營養(yǎng)與健康有重要的作用，現(xiàn)已應(yīng)用于食藥、飼料及化妝品等行業(yè)，并具有廣闊的市場前景[1]。ARA的傳統(tǒng)來源是從動(dòng)植物中提取，由于提取成本高和提取量少的特點(diǎn)使得其已無法滿足市場的需求[2]。因此研究人員開始致力于將微生物作為ARA來源的研究，特別是具有高產(chǎn)ARA能力的高山被孢霉得到了廣泛關(guān)注。

高山被孢霉生產(chǎn)的ARA通過了FDA 安全性評(píng)估并已進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，但其ARA的含量受發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源及無機(jī)鹽等組分的種類和添加量的影響較大。碳源可為菌體的生長增殖以及代謝產(chǎn)物的積累提供必需的碳成分和能量[3]，氮源則主要用于構(gòu)建菌體的含氮代謝物[4]，無機(jī)鹽是維持菌體內(nèi)酸堿平衡和滲透平衡的關(guān)鍵因素[5]，因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇合適的碳源、氮源、無機(jī)鹽的種類和添加量對(duì)提高高山被孢霉中ARA含量尤為重要。

目前存在較多高山被孢霉產(chǎn)ARA發(fā)酵培養(yǎng)基的組成方案及優(yōu)化方法，但在ARA含量和資源綜合利用等方面還需進(jìn)一步完善。本文以高山被孢霉BD-19為研究菌株，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)確定主要因素的最佳濃度組合，從而完成對(duì)高山被孢霉BD-19發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1 研究方法

1.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ARA含量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)從六個(gè)因素中篩選出四個(gè)影響ARA含量顯著的因素。其中Plackett-Burman試驗(yàn)中每個(gè)因素取低( -1)和高( 1) 兩個(gè)水平，試驗(yàn)因素和水平取值具體為：A 葡萄糖（60、120 g/L）、B 酵母提取物（10、20 g/L）、C KH2PO4（2、4 g/L）、D NaNO3（2、4 g/L）、E MgSO4（2、4 g/L）、F CaCl2（2、4 g/L）。

1.2 最陡爬坡試驗(yàn)

在Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)ARA含量變化梯度方向確定的爬坡方向和各因素效應(yīng)值大小確定的變化步長，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)以確定響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

1.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

在Plackett-Burman試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)以確定最佳的濃度組合。其中Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)中每個(gè)因素取低( -1) 、中（0）、高( 1)三個(gè)水平，試驗(yàn)因素和水平取值具體為：A 葡萄糖（50、60、70 g/L）、B 酵母提取物（7.5、9、10.5 g/L）、C KH2PO4（2.5、3、3.5 g/L）、D NaNO3（2.5、3、3.5 g/L）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)及有關(guān)數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。通過分析Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果后得到回歸方程：Y=5.973+0.549A-0.469B-0.316C+0.296D-0.078E-0.071F。并 由 此 可 知 各 因 素對(duì)ARA含量影響程度由大到小的排列順序?yàn)椋篈＞B＞C ＞D ＞E＞F。并且葡萄糖和酵母提取物對(duì)ARA含量影響達(dá)到極其顯著水平，KH2PO4和NaNO3達(dá)到顯著水平，而MgSO4和CaCl2影響不顯著。因此選擇顯著性相對(duì)較大的葡萄糖、酵母提取物、KH2PO4和NaNO3四個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 The design and results of the Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過分析最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果可知：隨著葡萄糖和KH2PO4濃度增加、酵母提取物和NaNO3濃度減小，ARA 含量先增加后減小。其中培養(yǎng)基組分為葡萄糖60 g/L，酵母提取物9 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaNO3 3 g/L時(shí)，ARA含量達(dá)到最大值，即此時(shí)培養(yǎng)基條件可作為Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與其結(jié)果見表2。通過分析Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果后得到擬合回歸方程：Y=7.592+1.170A+0.585B+0.300C+0.290D+0.228A★B+0.218A★C-0.070A★D+0.025B★C-0.183B★D+0.003C★D-0.860A2-1.593B2-0.310C2-0.788D2。并且在該試驗(yàn)中P＜0.0001、CV=7.62 %、Adeq Precision=13.412和失擬項(xiàng)為0.0995＞0.05，表明該模型線性關(guān)系顯著，失擬項(xiàng)差異不顯著且精密度良好，可用于高山被孢霉BD-19的ARA含量的預(yù)測。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The design and results of the Box-Behnken design

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

通過分析各因素濃度及其相互作用對(duì)ARA含量影響的三維曲面圖（如圖1）可知，響應(yīng)面分析圖均開口向下，說明回歸方程存在最大值，即存在最大的ARA含量。以ARA含量為響應(yīng)值，通過Design Expert 8.0.6軟件分析得到最佳濃度組合：葡萄糖 68.05 g/L，酵母提取物9.36 g/L，KH2PO4 3.39 g/L和NaNO3 3.06 g/L，并且此條件下理論上ARA含量可達(dá)到最大值8.27 g/L。

2.5 響應(yīng)面最優(yōu)條件驗(yàn)證

根據(jù)上述最佳濃度組合，對(duì)高山被孢霉BD-19進(jìn)行多批次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)搖瓶發(fā)酵7天后其ARA平均含量為8.25 g/L，與預(yù)測值( 8.27 g/L)的相對(duì)誤差為0.24%。此結(jié)果表明沒有顯著性差異，優(yōu)化模型穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

本研究基于響應(yīng)面分析法確定了高山被孢霉BD-19產(chǎn)ARA發(fā)酵培養(yǎng)基中四個(gè)主要因素的最佳濃度組合：葡萄糖68.05 g/L，酵母提取物9.36 g/L，KH2PO4 3.39 g/L和NaNO3 3.06 g/L。同時(shí)通過多批次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，ARA的平均含量為8.25 g/L，與預(yù)測值( 8.27 g/L)的相對(duì)誤差為0.24%，同時(shí)與優(yōu)化前的初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比，ARA含量提高了16.20%，為高山被孢霉BD-19工業(yè)化生產(chǎn)ARA提供了研究基礎(chǔ)。