顧覺奮

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009）

細(xì)菌耐藥性，是21世紀(jì)威脅人類健康最重要的元兇之一，也是全球關(guān)注的熱點(diǎn)。2016年WHO發(fā)布的全球耐藥菌報(bào)告中指出，耐藥細(xì)菌已蔓延至每一個(gè)國家，病原微生物對(duì)抗菌藥物耐藥的形勢(shì)越來越嚴(yán)峻，控制耐藥菌已經(jīng)成為刻不容緩的公共衛(wèi)生問題[1]。連續(xù)多年的全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(CARSS)數(shù)據(jù)顯示，耐亞胺培南肺炎克雷伯菌(IMP-RKPN)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素屎腸球菌(VREFM)、多重耐藥的銅綠假單胞菌和廣泛乃至全耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)，且檢出率不斷增加，因其所致感染病死率高引起臨床廣泛關(guān)注[2]。人們著手研究病原微生物的耐藥性機(jī)制，已知的細(xì)菌耐藥的分子和生化機(jī)制包括微生物可以通過產(chǎn)生耐藥性酶類催化抗生素失活、靶位的改變、細(xì)胞膜通透性的改變、生物膜形成以及外排泵(efflux pumps，EPs)等將抗生素排出細(xì)胞外，是臨床上固有耐藥和獲得性多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的主要機(jī)制[3]，尤其存在于耐藥革蘭陰性菌，如腸桿菌科，不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬中[4]。藥物學(xué)家們針對(duì)這些機(jī)制研制藥物，克拉維酸等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑已經(jīng)成功應(yīng)用到臨床上。近年來，以病原微生物細(xì)胞膜上的外排泵為靶點(diǎn)研制外排泵抑制劑(effl ux pump inhibitors，EPI)也受到了重視，本文從其作用機(jī)制、各類外排泵抑制劑、篩選方法等方面進(jìn)行了綜述，及對(duì)三維結(jié)構(gòu)的解析將有助于發(fā)現(xiàn)新的外排泵抑制劑。

1 外排泵

外排泵(efflux pumps)是指細(xì)菌將胞內(nèi)的藥物或毒性物質(zhì)排出胞外的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在外排過程中需要進(jìn)行質(zhì)子交換或水解ATP提供能量。根據(jù)氨基酸序列同源性和底物特異性，一般將這些外排泵分為5大類[5]：多藥及毒性化合物外排分子家族(multiantimicrobial and toxic compound extrusion，MATE)；主要促進(jìn)劑超家族(major facilitator superfamily，MFS)；小多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)分子家族(small multidrug resistance family，SMR)；耐藥性結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化分子家族(resistance nodulation division family，RND)；以及ATP結(jié)合盒超家族(ATP-binding cassette superfamily，ABC)(圖1)[6]。所有的外排泵家族均由質(zhì)?；蛉旧w編碼，具有不同的結(jié)構(gòu)形態(tài)與底物特異性。在真菌和人體中，涉及藥物外排的大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于ABC家族外排泵，通常被稱為主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用ATP水解的能量從細(xì)胞中泵出藥物。相應(yīng)的，MFS和SMR，RND和MATE超家族被稱為次級(jí)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用跨膜質(zhì)子動(dòng)力(PMF)或鈉/水合氫離子電化學(xué)梯度來促使藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出。

在這些外排泵中，RND家族研究得最為透徹。RND外排泵可以將大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素、四環(huán)素類、喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物泵出細(xì)菌體外。革蘭陰性菌大腸埃希菌有7個(gè)不同的RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表1)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為兩種不同的亞家族，為疏水性和兩親性外排RND(HAE-RND)和重金屬外排RND(HME-RND)[7]。

2 外排泵抑制劑作用機(jī)制

2.1 已知的5類外排泵的組成和一般作用機(jī)制

圖1 5類外排泵的簡單模式圖

(1)MATE家族具有12個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)域，面朝外的構(gòu)象具有兩個(gè)向內(nèi)膜外邊層開放的入口，有一個(gè)較寬的中心底物結(jié)合腔，其作用機(jī)制是由質(zhì)子勢(shì)能和鈉離子濃度梯度共同提供能量將藥物泵出胞外[8-9]。例如奧美拉唑(omeprazole)、泮托拉唑(pantoprazoIe)和蘭索拉唑(lansoprazole)皆為質(zhì)子泵(又稱H+.K+-ATP酶)抑制劑，它們能迅速穿過細(xì)胞膜破壞跨膜電化學(xué)梯度，阻斷外排泵的能量來源，從而避免藥物的外排[10]。

(2)MFS家族由兩種不同的蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即12碳和14碳跨膜結(jié)構(gòu)，14碳跨膜結(jié)構(gòu)由12碳跨膜結(jié)構(gòu)與輸水中央環(huán)組成。12碳跨膜蛋白是由一個(gè)編碼6碳跨膜結(jié)構(gòu)的基因重復(fù)表達(dá)并在膜內(nèi)外以軸對(duì)稱方式形成。兩個(gè)6碳穿膜α螺旋被稱為N、C蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域中的多個(gè)帶電荷氨基酸殘基能夠與質(zhì)子結(jié)合，利用胞內(nèi)外的質(zhì)子濃度梯度提供的化學(xué)勢(shì)能為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)供能，實(shí)現(xiàn)底物在胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)，其作用機(jī)制實(shí)質(zhì)上是一種交替通路機(jī)制。

(3)SMR家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白較小，只有4個(gè)跨膜區(qū)。是H+偶聯(lián)外排泵，即由質(zhì)子驅(qū)動(dòng)供能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，EmrE是其代表成員之一。其作用機(jī)制是前三個(gè)跨膜區(qū)中保守的氨基酸殘基側(cè)鏈與底物疏水部位結(jié)合，藥物與帶電荷殘基的質(zhì)子交換驅(qū)動(dòng)藥物進(jìn)出輸水通道，孔蛋白OmpW參與跨越外膜的EmrE特異性底物的流出[11]。阻斷位于外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)上的通道分子(如Tolc，OprlvI)來抑制外排泵，是指通過一種納米 小分子能特異性地結(jié)合在外排通道的活性部位上，形成空間位阻，從而更有效地阻礙外排泵通道。

(4)RND家族由36個(gè)跨膜的α螺旋構(gòu)成的三聚體結(jié)構(gòu)，三個(gè)單體分別是內(nèi)膜蛋白(inner membrane protein，IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周質(zhì)膜融合蛋白(periplasmic membran fusion proteins，MFP)。其作用機(jī)制是因IMP決定了外排泵作用底物的廣泛性，OMP與IMP為物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)形成通道，二者與MFP相互作用，促使外排泵系統(tǒng)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過進(jìn)入、結(jié)合、外排三個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，藥物與活性部位的結(jié)合形成過渡態(tài)中間產(chǎn)物，降低反應(yīng)的活化能，促進(jìn)底物的外排。

表1 大腸埃希菌的RND外排泵

(5)ABC家族由兩個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)及兩個(gè)親水細(xì)胞質(zhì)ATP結(jié)合域(NBD)組成。其作用機(jī)制是NBD水解ATP為細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量，TMD與底物特異性結(jié)合形成中間產(chǎn)物，通過構(gòu)象的改變將底物轉(zhuǎn)運(yùn)至膜外。

2.2 競爭性阻斷外排泵上的結(jié)合位點(diǎn)

有一類抑制劑與外排泵的活性部位具有較高的親和力，通過與抗生素競爭細(xì)菌外排泵的活性部位來減少藥物的外排，人們針對(duì)外排泵設(shè)計(jì)并合成了不同的抑制劑。這些藥物并不會(huì)直接作用于外排泵產(chǎn)生的多重耐藥菌株，而是以抗生素分子通過競爭性地在外排泵上的結(jié)合位點(diǎn)，以避免藥物的外排。例如，13-CPTC是四環(huán)素的一個(gè)結(jié)構(gòu)類似物，能競爭性地與細(xì)菌B型四環(huán)素外排泵結(jié)合，阻斷外排泵對(duì)四環(huán)素類抗生素的外排作用，從而躲避細(xì)菌將其泵出胞外，胞內(nèi)最終使?jié)舛冗_(dá)到有效值范圍而殺死細(xì)胞。

2.3 基因水平抑制外排泵的表達(dá)

反義核苷酸或小分子RNA選擇性的抑制編碼外排泵基因的表達(dá)。Liu等[12]報(bào)道了銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)外排泵MexAB-OprM的功能受到了siRNA抑制，分析認(rèn)為銅綠假單胞菌中可能存在RNA誘導(dǎo)基因特異沉默現(xiàn)象。據(jù)此，龔鳳云等[13]針對(duì)銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM設(shè)計(jì)兩條siRNA序列，合成了與兩條siRNA一致的DNA序列，通過分子生物學(xué)的方法將雙鏈DNA序列克隆到pGPU6／GFP／Neo-siRNA載體中，構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，采用電穿孔方法轉(zhuǎn)化PA01細(xì)胞，通過E-test檢測siRNA2干擾PA01，PA01對(duì)美羅培南(Meropenem)、頭孢他啶(Ceftazidime)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)的耐藥性都明顯降低，進(jìn)一步RT-PCR方法證實(shí)siRNA2干擾PA01后外排泵MexAB-OprM中MexB基因的mRNA表達(dá)明顯下降，上述結(jié)果說明應(yīng)用siRNA分子干擾銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的MexB基因，可以降低細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性，提高銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的敏感性。

3 外排泵抑制劑

3.1 化學(xué)合成來源EPIs(Effl ux Pumps Inhibitors)

3.1.1 化合物Tariquidar

Tariquidar[14]是目前為止第三代MDR調(diào)節(jié)物中最具前景的代表性藥物。它是在篩選哺乳動(dòng)物ABC族外排泵抑制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)的，特別對(duì)P-糖蛋白(P-gp)和哺乳動(dòng)物乳癌細(xì)胞耐藥蛋白(BCRP，ABCG2)有很好 的抑制作用。最新報(bào)道，第三代P-糖蛋白抑制劑Tariquidar對(duì)細(xì)菌多重耐藥性的抑制作用，將金黃色葡萄球菌29213(SA29213)和1199B(SA1199B，NorA過表達(dá))、銅綠假單胞菌27853、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌BAA-85分別置于環(huán)丙沙星+Tariquidar及無抑制劑條件下，來評(píng)估其P-糖蛋白抑制劑的作用。Tariquidar的活性效果在SA1199B中最明顯，通過加入tariquidar使環(huán)丙沙星的MIC值降低了10倍。Tariquidar本身不是P-糖蛋白的底物，它與P-糖蛋白的結(jié)合是特異性的，非競爭性的，它結(jié)合在P-糖蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)上，通過抑制ATP酶活性起作用。臨床試驗(yàn)表明，聯(lián)合本品可使多柔比星、紫杉醇、長春瑞濱的IC由2.57，27.4和15.5mmol/L分別降到1.67，20.6和9.5mmol/L，其優(yōu)點(diǎn)在于其不影響CYP3/A4的代謝。已開發(fā)到Ⅱ/Ⅲ臨床研究階段，能恢復(fù)癌細(xì)胞對(duì)化療制劑的敏感性。

3.1.2 維拉帕米(Verapami，VER)及其類似物

維拉帕米(Verapami，VER)是鈣通道阻斷劑，近年來用于治療高血壓、心絞痛、心律失常等，研究證明，維拉帕米阻斷結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的外排泵，能夠降低各種抗分枝桿菌藥物的最小抑制濃度(MIC)[15]。維拉帕米的原核外排泵抑制機(jī)制尚未完全闡明，一些研究認(rèn)為維拉帕米在生理pH下是質(zhì)子化的兩親性分子(pKa 9.68)，使維拉帕米能溶解在脂質(zhì)雙分子層中，其蓄積可增加細(xì)菌膜通透性并干擾膜蛋白的功能。Chen等[16]就維拉帕米與抗結(jié)核分枝桿菌藥物的協(xié)同作用證實(shí)了這一研究機(jī)制。與一些膜活性劑類似，VER破壞膜功能并誘導(dǎo)膜應(yīng)激反應(yīng)，從而與抗結(jié)核桿菌藥物如利福平或貝達(dá)喹啉產(chǎn)生協(xié)同作用，為此人們?nèi)詫⒕S拉帕米作為開發(fā)可用的EPI先導(dǎo)化合物。進(jìn)一步研究表明R-Verapamil和去甲維拉帕米(Norverapamil，圖2)與Verapamil對(duì)于降低感染巨噬細(xì)胞模型中巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的藥物耐受性同樣有效，在機(jī)制層面上也說明了逆轉(zhuǎn)耐藥性的機(jī)制與維拉帕米類似物的哺乳動(dòng)物鈣通道活性并無直接關(guān)系。隨后合成了一系列維拉帕米類似物并計(jì)算了抑制濃度指數(shù)(FICI)，對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)其中的化合物7d(圖2)顯示出最好的協(xié)同活性(FICI=0.3)，對(duì)照組維拉帕米的 FICI為0.5。

3.1.3 化合物PAβN

很多EPI的重要先導(dǎo)化合物，P-糖蛋白抑制劑像利血平和維拉帕米等，金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的外排泵抑制劑而被廣泛研究，能減少阿霉素，嘌呤霉素等的泵出。MexB和AcrB革蘭陰性菌RND泵具有最廣泛的底物特異性，既可泵出中性化合物(如氯霉素)又可泵出酸性化合物(如β-內(nèi)酰胺類)。Opperman等[17]報(bào)道PAβN(MC-207 110，苯丙氨酸-精氨酸β-萘酰胺，Phenylalanyl arginyl β-naphthylamide)作為廣譜抑制劑，可抑制銅綠假單胞菌中3種主要RND泵：MexAB-OprM，MexCD-OprJ和MexEFOprN，能有效減少氟喹諾酮等的外排，也可抑制大腸埃希菌的AcrAB-TolC泵。濃度為20μg/mL的PAβN存在時(shí)，各種抗生素對(duì)MexAB-OprM過量表達(dá)的銅綠假單胞菌菌株的MIC均有不同程度的下降，例如氯霉素和司帕沙星的MIC降低128倍，紅霉素和左氧氟沙星的MIC降低32倍。其抑制作用可能是運(yùn)輸過程中與藥物競爭結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)果。Lamers[18]雖曾報(bào)道了PAβN外膜透化活性的理論，隨后Misra等[19]最終認(rèn)為：PAβN的主要作用機(jī)制是抑制外排泵活性，而后延長PAβN溫育時(shí)間，才體現(xiàn)較弱的膜去穩(wěn)定作用，可能在未充分表達(dá)外排泵的細(xì)胞中，PAβN的細(xì)胞壁透化作用才會(huì)被放大。盡管對(duì)PAβN結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，試圖改善活性、血清穩(wěn)定性，將其急性毒性降低至可耐受的水平，但其結(jié)構(gòu)中固有的兩種陽離子基團(tuán)，導(dǎo)致在組織中長時(shí)間的積聚而無法重復(fù)給藥，以致引起嚴(yán)重的腎毒性，因此，一系列的結(jié)構(gòu)改造均沒有取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

3.1.4 化合物SILA421

圖2 維拉帕米及其衍生物結(jié)構(gòu)

最早由Martins等[20]發(fā)現(xiàn)一種對(duì)多藥耐藥、廣泛耐藥結(jié)核(MDR/XDR-TB)有殺滅作用的化合物SILA421，試驗(yàn)了體內(nèi)外抗XDR-TB活性，發(fā)現(xiàn)SILA 421(MIC＜3.5mg/L)使非殺傷巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛行淌杉?xì)菌殺手，它不僅抑制敏感結(jié)核菌和XDR-TB菌，還抑制腫瘤細(xì)胞的外排泵活性，使得吞噬體內(nèi)鉀離子和鈣離子濃度過高而增加肺巨噬細(xì)胞的殺菌效果，且未對(duì)人體細(xì)胞顯示出任何毒性，展現(xiàn)出有潛力成為一種新型抗耐藥結(jié)核藥物。

四年后，Simons等[21]報(bào)道，體外單獨(dú)使用時(shí)，SILA-421顯示出濃度依賴性和時(shí)間依賴性的殺菌活性，能增強(qiáng)異煙肼(Isoniazid，INH)和利福平(Rifampicin，RIF)的對(duì)耐多藥結(jié)核病的療效，且與INH有良好的協(xié)同作用，可防止出現(xiàn)INH暴露后的INH抵抗。然而SILA-421并不能增強(qiáng)莫西沙星(Moxifloxacin，MXF)或阿米卡星(Amikacin，AMK)的效果。此外，SILA-421還可增強(qiáng)RIF對(duì)抗RIF菌株的活性，并能夠完全清除抗RIF分枝桿菌。遺憾的是，在基因型菌株誘導(dǎo)的結(jié)核病小鼠中，異煙肼-利福平-吡嗪酰胺治療方案中添加SILA-421，13周后并沒有觀察到增強(qiáng)的療效[22]。

3.1.5 吡喃并吡啶化合物(MBX2319)及其類似物D13-9001

近二十年來，人們不斷嘗試開發(fā)可用于臨床的RND外排泵抑制劑。最早的是擬肽EPI家族，包括化合物PAβN。革蘭陰性菌EPIs開發(fā)的第二個(gè)重要的里程碑便是一系列吡啶并嘧啶EPIs，其代表是D13-9001，作為先導(dǎo)化合物已進(jìn)入臨床前開發(fā)階段。吡啶并嘧啶EPIs對(duì)于銅綠假單胞菌的MexAB外排泵具有較強(qiáng)的特異性，對(duì)MexXY泵沒有活性，這可能是導(dǎo)致其在2007年發(fā)展停滯的一個(gè)主要原因[23]。MBX2319不具有膜破壞性或內(nèi)在的抗菌活性，還可增強(qiáng)AcrB底物抗生素的活性，包括氟喹諾酮類，β-內(nèi)酰胺類，紅霉素，氯霉素以及利奈唑胺等，而且對(duì)肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌、陰溝腸桿菌和弗氏志賀菌等其抑制活性譜全部涵蓋。MBX2319在大腸埃希菌中的主要靶標(biāo)是完整的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB。為了深入了解MBX2319抑制的分子機(jī)制，Vargiu等[24]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬確定MBX2319在AcrB底物結(jié)合口袋中的結(jié)合位點(diǎn)，并預(yù)測MBX2319同D13-9001一樣，與AcrB結(jié)合在“疏水阱”。不久，Sjuts(法蘭克福歌德大學(xué)) [25]獲取了與AcrBper(一種工程蛋白，由可溶形式的AcrB周質(zhì)“搬運(yùn)工”結(jié)構(gòu)域組成)結(jié)合的MBX2319的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MBX2319與T原體的疏水阱結(jié)合，在疏水阱中，與深層結(jié)合口袋和疏水阱內(nèi)部的疏水殘基相互作用。

3.1.6 Timcodar(VX-853)

Grossman 等[26]關(guān)于P-糖蛋白抑制劑Timcodar(VX-853)的研究歷久彌新，在體外研究中，當(dāng)Timcodar單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)肉湯培養(yǎng)的耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MTB)有著較弱的抑制作用(MIC=19μg/mL)；同樣條件下，Timcodar與利福平(RIF)，貝達(dá)喹啉(Bedaquiline)和氯法齊明(Clofazimine)合用，則顯示出良好的協(xié)同作用；而以巨噬細(xì)胞為宿主培養(yǎng)結(jié)核桿菌時(shí)，Timcodar與RIF，莫西沙星或Bedaquiline聯(lián)合使用，對(duì)耐多藥結(jié)核病抑制作用 更是提高了約10倍(50%抑制濃度為1.9μg/mL)。Timcodar在小鼠模型中可增強(qiáng)RIF和異煙肼(INH)的作用，減少肺部Mtb負(fù)荷，并降低慢性感染的復(fù)發(fā)率，G rossman等認(rèn)為，這種增強(qiáng)作用可能是由Timcodar自身的抗菌活性和宿主靶向機(jī)制相結(jié)合的結(jié)果。然而，De等[27]使用時(shí)間-殺菌動(dòng)力學(xué)測定法，卻發(fā)現(xiàn)維拉帕米和Timcodar均不能提高莫西沙星+利奈唑胺抗結(jié)核感染的活性。

3.2 微生物代謝來源EPIs

3.2.1 米爾貝霉素(Milbemycins)

米爾貝霉素(Milbemycins)是由幾種鏈霉菌產(chǎn)生的一種十六員大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有強(qiáng)烈的殺蟲和殺螨等生物學(xué)活性。ATP結(jié)合盒(ABC)多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)是對(duì)唑類抗真菌劑的臨床抗性的重要原因，Niimi等[28]證實(shí)米爾貝霉素是真菌多藥耐藥外排泵潛在的廣譜有效抑制劑，他們報(bào)道了識(shí)別和表征米爾貝霉素抗白念珠菌和光滑念珠菌的多藥耐藥外排泵，選定釀酒酵母菌株表達(dá)，使用了CaCdr1p、CaCdr2p、CgCdr1p、CgPdh1p和ScPdr5p等，每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白回應(yīng)以獨(dú)特的方式進(jìn)行了試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過度CaCdr1p抑制突變體(10株)或CaCdr2p (4株)對(duì)Milbemycin alpha25呈抗性，每個(gè)CaCdr1p抑制突變對(duì)其他3個(gè)外排泵抑制劑(他克莫司、恩鐮孢菌素、白僵菌素)導(dǎo)致不同的反應(yīng)，也影響了其底物特異性。說明了米爾貝霉素alpha25是通過穩(wěn)定這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的開放構(gòu)象來抑制CaCdr1p和CaCdr2p泵的功能。

3.2.2 大觀霉素類似物

大觀霉素(Spectinomycin)是鏈霉菌產(chǎn)生的一種氨基糖苷類的抗生素，具有較強(qiáng)的細(xì)菌核糖體親和力，與傳統(tǒng)氨基糖苷類抗生素類似，能選擇性結(jié)合細(xì)菌核糖體亞基，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。出乎意料的是，大觀霉素抗結(jié)核分枝桿菌的活性遠(yuǎn)不如氨基糖苷類，這可能歸因于外排泵Rv1258c對(duì)大觀霉素大量外排。Lee等[29]通過用各種酰胺羰基連接的官能團(tuán)取代糖上的酮基，設(shè)計(jì)了一系列大觀霉素類似物(Spectinamides)，企圖避免細(xì)菌的主動(dòng)外排，其中吡咯和哌啶環(huán)，特別是鹵素取代的哌啶類似物表現(xiàn)出最好的抗分枝桿菌和抑制外排泵的活性。后續(xù)研究獲得了酰胺衍生物1599(Spectinamide1599)，能夠大幅降低各種抗分枝桿菌抗生素(包括克拉霉素，多西環(huán)素和克林霉素)的MIC，然而酰胺衍生物1599并不能增強(qiáng)大觀霉素的活性，這表明Spectinamide1599并不是通過抑制Rv1258c的外排功能來規(guī)避其介導(dǎo)的耐藥性[30]。

3.3 天然產(chǎn)物來源EPIs

3.3.1 利血平(Reserpine，RES)

利血平(RES)是被廣泛用于治療輕度或中度高血壓且伴有鎮(zhèn)靜作用的吲哚生物堿。早期的研究表明，RES可以抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的四環(huán)素外排泵Tet(K)，并使四環(huán)素對(duì)MRSA的MIC從128μg/mL降低至32μg/mL，針對(duì)多藥耐藥性革蘭陽性菌，利血平顯示的EPI活性涵蓋了ATP結(jié)合盒(ABC多藥外排)超家族和主要促進(jìn)劑超家族(MFS)。隨后，一些學(xué)者認(rèn)為RES可能通過抑制MmpL7，IniA和P27-P55外排泵來逆轉(zhuǎn)MTB對(duì)INH和溴乙錠(EtBr)的耐藥性。Sun等[31]的研究也證實(shí)RES能夠降低甚至逆轉(zhuǎn)廣泛耐藥(XDR)MTB、多藥耐藥(MDR)MTB對(duì)氧氟沙星的耐藥性。

3.3.2 粉防己堿(Tetrandrine)

粉防己堿是來源于植物粉防己塊根中提煉的治療支氣管哮喘的雙芐基異喹啉類生物堿。與維拉帕米類似，粉防己堿是L-型鈣通道和P-糖蛋白抑制劑，因此，很可能與維拉帕米相似的機(jī)制調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌外排泵的活性[32]。Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)粉防己堿可降低異煙肼(INH)和乙胺丁醇(EMB)對(duì)多重耐藥MTB的MIC，有效率高達(dá)82%，認(rèn)為將INH或EMB與粉防己堿聯(lián)合使用不僅提高抗TB效果，且有助于減少藥物劑量和副作用。也有報(bào)道粉防己堿能提高銅綠假單胞菌對(duì)氧氟沙星的敏感性。

3.3.3 小檗堿(Berberine)

小檗堿與胡椒堿在結(jié)構(gòu)上很相似，具有微弱的抗微生物活性，是廣泛存在于小檗屬植物中的兩親性異喹啉生物堿，也是目前公認(rèn)的外排泵底物。與抗生素聯(lián)用時(shí)，小檗堿的細(xì)胞內(nèi)濃度增加，抗菌效果增強(qiáng)。由于競爭性抑制外排泵，抗生素效應(yīng)也有所增強(qiáng)[34]。晶體學(xué)研究證實(shí)，小檗堿可以通過結(jié)合NorA和RamR外排泵，從而抑制多藥耐藥金黃色葡萄球菌甚至MTB細(xì)菌的生長[35]。然而，小檗堿的口服生物利用度明顯較低，口服給藥后由于胃腸道吸收差，加之嚴(yán)重的首過代謝及P-糖蛋白介導(dǎo)的外排而導(dǎo)致血漿水平低下，因此對(duì)小檗堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造引起了不少研究人員的重視。

3.3.4 辣椒素和胡椒酚乙酸酯(Capsaicin acetoxychavicol acetates,ACA)

Kalia等[36]用辣椒素(8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺)與環(huán)丙沙星聯(lián)合測試對(duì)金黃色葡萄球菌SA-1199B(NorA過表達(dá))，SA-1199(野生型)和SAK1758(NorA敲除)的活性。發(fā)現(xiàn)辣椒素顯著降低環(huán)丙沙星對(duì)金黃色葡萄球菌SA-1199和SA-1199B的MIC。此外，辣椒素在MIC濃度下也延長了環(huán)丙沙星的抗生素后效應(yīng)1.1h。證明一種新型的EPI—辣椒素，可以抑制金葡菌的NorA外排泵。

Roy等[37]發(fā)現(xiàn)分離自高良姜莖塊的苯丙素類調(diào)制因子也可以作為恥垢分枝桿菌的外排泵抑制劑。其中1′-S-1′-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(1′-S-1′-acetoxychavicol acetate)，反式-對(duì)-香豆醇酯(transp-coumaryl diacetate)和1′-S-1′-乙酰氧丁香酚乙酸酯(1′-S-1′-acetoxyeugenol acetate)被認(rèn)為是強(qiáng)效調(diào)節(jié)劑，其濃度分別為2.5，6.25和5.0mg/L時(shí)，能使溴化乙錠的MIC降低64倍。

3.3.5 錐絲堿(Conessine)

止瀉木(Holarrhena antidysenterica)是用作治療痢疾、發(fā)熱和細(xì)菌感染的傳統(tǒng)中草藥，其主要活性成分均具有抗腹瀉和抗瘧原蟲的活性。Siriyong等[38]對(duì)止瀉木的提取物錐絲堿(Conessine)研究發(fā)現(xiàn)，本品能夠提高廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素的敏感性，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)MexAB-OprM外排泵參與該機(jī)制。在MexAB-OprM過表達(dá)的菌株中，Conessine使抗生素的MIC降低至少8倍，對(duì)頭孢噻肟，左氧氟沙星和四環(huán)素的敏感性甚至達(dá)到野生型菌株的水平。而在MexB缺陷型菌株中觀察到的Conessine與抗生素之間的協(xié)同作用則表明，Conessine很可能會(huì)抑制銅綠假單胞菌中存在的其他外排系統(tǒng)。

另外，復(fù)方清熱顆粒能抑制鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵[39]、穿心蓮內(nèi)酯具有抑制銅綠假單胞菌外排泵MexAB OprM的作用[40]、連翹酯苷B可抑制肺炎克雷伯菌外排泵的活性[41]等都被發(fā)現(xiàn)具有外排泵作用。

4 EPIs的篩選方法

隨著蛋白質(zhì)的三維晶體結(jié)構(gòu)的深入研究，人們根據(jù)藥物與外排泵蛋白的相互作用設(shè)計(jì)一些外排泵抑制劑(EPI)。經(jīng)過眾多課題組的努力已經(jīng)完成了一些多藥耐藥外排泵的X射線蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析工作，為這一領(lǐng)域的研究做出很好的貢獻(xiàn)和鋪墊。

大腸埃希菌的多藥外排泵AcrAB-TolC系統(tǒng)是目前研究比較清楚的一種細(xì)菌外排泵。Du等[42]報(bào)道AcrAB-TolC系統(tǒng)主要有3個(gè)部分組成：膜融合蛋白(AcrA)、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)如圖3所示。

4.1 基于藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫的虛擬篩選EPIs

從研究得最透徹的RND(Resistance Nodulation Division)家族出發(fā)，RND蛋白超家族多藥耐藥外排泵的過度表達(dá)其中主要原因是微生物耐藥性。了解這個(gè)過程的分子基礎(chǔ)是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的主要挑戰(zhàn)之一，涉及到范圍廣泛的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算技術(shù)。首先可利用藥效團(tuán)模型篩選針對(duì)AcrB和MexB外排泵的抑制劑，Ruggerone等[43]報(bào)道了用分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)模擬RND多藥耐藥外排泵研究狀態(tài)，以獲得大腸埃希菌和銅綠假單胞菌耐藥介導(dǎo)的外排泵功能機(jī)制。Aparna等[44]采用基于藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫的虛擬篩選，努力識(shí)別對(duì)銅綠假單胞菌MexB蛋白(圖4)有活性的化合物。根據(jù)已知的抑制劑MC-207,110(圖5)創(chuàng)建了藥效團(tuán)假說，用藥效團(tuán)模型從數(shù)據(jù)庫篩選了392個(gè)天然化合物和195000個(gè)合成化合物，根據(jù)軟件的評(píng)分顯示出入圍的化合物與活性位點(diǎn)的相互作用(圖6)，使用Glide_XP將入圍的化合物與靶蛋白銅綠假單胞菌的MexB對(duì)接。

圖3 AcrAB-TolC復(fù)合物的模型

Aparna團(tuán)隊(duì)[45]使用高通量虛擬篩選技術(shù)，利用藥效團(tuán)模型篩選針對(duì)AcrB和MexB外排泵的抑制劑，最終確定兩種對(duì)大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中AcrB和MexB蛋白有較好抑制活性的天然產(chǎn)物—毛花苷C(lanatoside C)和大豆苷元(Diadzein)。Astolfi等[46]也通過開發(fā)兩種新型3D藥效團(tuán)模型，篩選出了3個(gè)有效抑制金黃色葡萄球菌中NorA外排泵的化合物。當(dāng)然，模擬篩選出的物質(zhì)還要用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4.2 基于定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)

分子機(jī)制和定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structureactivity relationship，QSAR)的研究對(duì)于理性設(shè)計(jì)、合理修飾，是對(duì)先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造、優(yōu)化其活性的重要方法。以革蘭陰性菌嚴(yán)重耐藥的RND外排泵為例，最具臨床研究價(jià)值的抑制劑是以MBX2319為代表吡喃并吡啶化合物，基于定量構(gòu)效關(guān)系的研究，Nguyen等[47]合成了一系列MBX2319衍生物，并證實(shí)化合物22d～f，22i和22k在增強(qiáng)左氧氟沙星和哌拉西林抗大腸埃希菌活性方面比原藥更有效。隨后該課題組繪制了MBX2319骨架結(jié)構(gòu)的分子活性圖譜，鑒別出對(duì)外排泵抑制活性至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)中心，以及可以被修飾以提高活性、代謝穩(wěn)定性和溶解度結(jié)構(gòu)域，新獲得的幾個(gè)衍生物結(jié)構(gòu)，在原有活性的基礎(chǔ)上，具有更優(yōu)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)[48]。然而，除了吡喃并吡啶類EPIs，由于毒性等因素停滯在臨床前或者體外實(shí)驗(yàn)的眾多EPIs，都需要進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改進(jìn)，以獲得溶解度更好、清除機(jī)制較慢的新化合物以達(dá)到體內(nèi)活性的優(yōu)化。定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型已被證明對(duì)預(yù)測化合物的活性具有良好的預(yù)測能力。

圖4 銅綠假單胞菌MexB蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

5 結(jié)語

病原菌的多藥耐藥性是目前臨床感染中非常棘手的問題，其中常見的原因之一是細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)對(duì)多種藥物的 外排作用。多藥耐藥外排泵廣泛存在于各種病原菌中，對(duì)于細(xì)菌來說，外排基因占所有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的6%～18%，如外排系統(tǒng)的過度表達(dá)主導(dǎo)革蘭陰性菌銅綠假單胞菌耐藥性發(fā)生，尤其MexAB-OprM在耐藥形成中起最主要作用，所以外排基因編碼的外排泵是導(dǎo)致其多重耐藥的重要機(jī)制。大量針對(duì)大腸埃希菌的多藥外排泵RND型AcrAB-TolC和Mex泵的研究，金黃色葡萄球菌的NorA外排蛋白等，有益于加深人們對(duì)細(xì)菌多藥耐藥性機(jī)制的認(rèn)識(shí)，揭開了MDR泵的耐藥機(jī)制的結(jié)構(gòu)與生化基礎(chǔ)，更好地理解外排泵之間以及與其他耐藥機(jī)制之間的協(xié)同相互作用，可以為藥物的發(fā)現(xiàn)提供更多的靶點(diǎn)，對(duì)三維結(jié)構(gòu)的解析將有助于發(fā)現(xiàn)活性更好的新型外排泵抑制劑。開發(fā)安全有效的外排泵抑制劑對(duì)提高抗菌藥物的抗菌活性和改善臨床治療細(xì)菌感染疾病的現(xiàn)狀具有重要的意義。

圖5 MexB-OprM外排泵抑制劑MC-207,110的結(jié)構(gòu)

圖6 對(duì)接顯示MexB的活性殘基與MC-207,110的相互作用

已經(jīng)報(bào)道的這些來源于化學(xué)合成、微生物代謝以及天然產(chǎn)物的各類第三代外排泵抑制劑，有的甚至是廣譜外排泵抑制劑(如PAβN)，具有逆轉(zhuǎn)廣泛耐藥性，有的已開發(fā)到Ⅱ/Ⅲ臨床研究階段(如Tariquidar)，還通過基于藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫的虛擬篩選、基于定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等，來尋找新型外排泵抑制劑。但多數(shù)還處于臨床前階段或體外試驗(yàn)，開發(fā)能夠規(guī)避MDR的新型抗生素或臨床有效的外排泵抑制劑時(shí)，我們?nèi)砸邮苤鵁o數(shù)的挑戰(zhàn)，鑒于許多外排泵具有廣泛的底物特異性，而臨床分離菌株在治療期間出現(xiàn)的EP快速選擇性過表達(dá)，我們必須再一次強(qiáng)調(diào)優(yōu)化抗菌藥物聯(lián)合使用和減少抗生素濫用的重要性。