蘇晶，胡錦東，劉新泉，方越，董志國，王大虎

干眼的形成主要受內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境的影響，外環(huán)境主要指人們所處的不利的生活工作職業(yè)環(huán)境，例如較低相對濕度、較高空氣流量環(huán)境等。不利的環(huán)境因素存在于每個地方，尤其是干旱或半干旱有著溫?zé)釟夂虻牡貐^(qū)；此外，成千上萬的人正處于人工創(chuàng)造的各種不利的環(huán)境中，比如空調(diào)建筑、車間或飛機(jī)艙等[1]，這些環(huán)境中的人群往往更容易造成出現(xiàn)干眼相關(guān)的癥狀和表現(xiàn)。

秦皮滴眼液由秦皮和冰片組成，具有祛風(fēng)明目、清熱解毒之功效，是滬上著名中醫(yī)眼科范新孚教授祖?zhèn)髅胤剑瑫r也是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院長期使用的院內(nèi)自制試劑，對于干眼引起的眼睛干澀、灼熱、癢感、異物感及視疲勞等癥狀療效肯定，作用持久且無刺激及副作用[2]。但其作用機(jī)制尚不明確。擬通過本次實驗評價秦皮滴眼液對單純環(huán)境因素誘導(dǎo)的大鼠干眼模型角膜上皮損害和眼表炎癥的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本研究對動物的處理及實驗步驟均遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)及視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會 （association for research in vision and ophthalmology，ARVO） 關(guān)于眼科與視覺研究中心動物使用的相關(guān)規(guī)定和條例。選擇60只4～6周齡健康雌性Balb/c大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。試驗前進(jìn)行角膜熒光素染色（fluorescein staining，F(xiàn)L）檢測角膜健康情況，排除有角膜點染、潰瘍的大鼠。

以體重為區(qū)組因素隨機(jī)將大鼠分為正常對照組、干眼模型組、秦皮治療組，每組20只。

1.2 實驗方法

1.2.1溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)建立 參考Chen W等[3-5]提出的方法建立智能環(huán)境控制系統(tǒng)（intelligent control environment system，ICES）并對其加以改善創(chuàng)新，通過改裝冷風(fēng)機(jī)、隔熱材料、防潮材料、密封材料及控溫機(jī)等建立溫控模型房，同時應(yīng)用2臺高級智能除濕機(jī)，最終建立起溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使得溫度控制在（25.8±1.7）℃、相對濕度（relative humidity，RH）控制在（12.7±0.8）%。

1.2.2造模 正常對照組大鼠飼養(yǎng)于自然環(huán)境中，T 24～26℃，RH60%～75%，秦皮治療組和干眼模型組均飼養(yǎng)于溫控模型房中。秦皮治療組采用微量加液器吸取秦皮滴眼液進(jìn)行點眼，每日5次，每次2 μl，共28 d，干眼模型組和正常對照組不點眼藥水。各組大鼠在飼養(yǎng)期間給予充足飲水、混合飼料及正常日照，2 d更換墊料，保持清潔干燥。

造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：與正常對照組比較，出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的淚液分泌量減少即表明干眼造模成功。

1.2.3實驗過程 于實驗開始前和置于智能環(huán)境控制系統(tǒng)后第7 d、14 d、2l d、28 d行酚紅棉線試驗和淚液蕨樣變試驗。于第28 d完成上述檢查后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行全身麻醉，頸椎脫臼法處死大鼠，取連帶上眼瞼、下眼瞼及完整結(jié)膜的眼球，置于4%多聚甲醛中固定。

1.3 酚紅棉線試驗

酚紅棉線 （購自天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司），放大鏡下使用顯微鑷夾住酚紅棉線轉(zhuǎn)折處，將其置于大鼠下瞼結(jié)膜囊的中外1/3處，60 s后取出，測量酚紅棉線濕潤長度并記錄數(shù)據(jù)，以此作為淚液分泌量的評價指標(biāo)。

1.4 淚液蕨樣變試驗

無表面麻醉情況下采用毛細(xì)玻璃管從內(nèi)眥部吸取2 μl淚液，取樣過程不觸及角膜和結(jié)膜，以免引起刺激性淚液，將吸取的淚液小心置于干凈的載玻片上，26℃環(huán)境中待淚液自然干燥，通過光學(xué)顯微鏡觀察淚液結(jié)晶形態(tài)并照相記錄。

1.5 病理組織學(xué)檢查

各組大鼠的眼球沿角膜緣環(huán)形剪下角膜和角膜緣外3～4 mm的結(jié)膜組織，采用石蠟包埋切片，行病理組織學(xué)檢查。通過角膜蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，觀察角膜上皮細(xì)胞學(xué)形態(tài)。結(jié)膜通過過碘酸-雪夫染色法(periodicacid-schiff，PAS)染色觀察結(jié)膜杯狀細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目。

1.6 免疫熒光染色法檢測CD4＋T細(xì)胞的數(shù)量

大鼠角膜組織經(jīng)石蠟包埋后，冰凍切片3 μm，室溫放置30 min以上，用4 ℃丙酮固定10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗5 min×3次；3%過氧化氫 （hydrogen peroxide，H2O2）孵育5 min，PBS洗5 min×2次。0.01 mmol/L PBS（PH7.2～7.4）浸洗30 min；1%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）-PBS封閉30 min，傾去；加1:100稀釋的CD4+一抗（Abcam公司），置濕盒中4℃過夜；次日拿出濕盒，棄一抗，0.01mmol/LPBS（PH7.2～7.4）沖洗，3 min×3次；滴加1:100稀釋Alexa Fluor647標(biāo)記二抗 （1%BSA-PBS稀釋，Abcam公司），37 ℃孵育30 min；棄二抗，0.01 mmol/L PBS（PH7.2～7.4）洗3 min×3次；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染細(xì)胞核20 min，PBS洗3 min×3次；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用單因素方差分析處理，兩兩之間比較用Q檢驗。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酚紅棉線試驗

采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，3組大鼠的淚液分泌量在基點處相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。14 d時干眼模型組出現(xiàn)淚液減少。21 d時干眼模型組大鼠與正常對照組比較淚液分泌量減少，秦皮治療組淚液分泌量較干眼模型組多，F(xiàn)=9.988，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；第28 d時，秦皮治療組較干眼模型組淚液分泌量增多，F(xiàn)=27.769，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 淚液蕨樣變試驗

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組從第0 d至第28 d均能觀察到大鼠淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)良好；干眼模型組大鼠隨著在溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)中時間的延續(xù)，淚液蕨類結(jié)晶排列逐漸變得不規(guī)則，出現(xiàn)斷裂與減少，至第28 d可見蕨類結(jié)晶較正常對照組明顯稀疏減少，甚至消失；秦皮治療組在各時間點淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)均較干眼模型組大鼠良好，但不如正常對照組蕨類結(jié)晶形態(tài)規(guī)則、密集。3組大鼠第28 d淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)（圖1）。

表1 3組大鼠的酚紅棉線試驗結(jié)果比較（）

表1 3組大鼠的酚紅棉線試驗結(jié)果比較（）

注：* 與同時間點正常對照組比較，P＜0.05；# 與同時間點干眼模型組比較，P＜0.05

圖1 3組大鼠第28 d淚液蕨類結(jié)晶形態(tài)圖1A正常對照組，形態(tài)完整，連接緊密而無斷裂；1B干眼模型組，稀疏有空隙，出現(xiàn)斷裂；1C秦皮治療組，形態(tài)良好，排列緊密規(guī)則

2.3 病理組織學(xué)檢查

2.3.1角膜HE染色 第28 d光鏡下對3組大鼠角膜行HE染色后可見，正常對照組Balb/c大鼠眼球角膜上皮細(xì)胞分層良好，排列規(guī)則，基底部細(xì)胞呈柱狀排列，并且向角膜上皮逐漸分化為鱗狀上皮細(xì)胞；干眼模型組大鼠經(jīng)過28 d溫控-濕控調(diào)節(jié)系統(tǒng)造模后角膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生，上皮明顯增厚；秦皮滴眼液治療組結(jié)構(gòu)較為良好，厚度未見明顯變化（圖2）。

圖2 3組大鼠第28 d角膜HE染色后角膜上皮細(xì)胞圖2A正常對照組，各層細(xì)胞排列整齊，分層良好；2B干眼模型組，角膜上皮增生變厚；2C秦皮治療組，厚度未見明顯變化

2.3.2結(jié)膜PAS染色第28 d對3組大鼠結(jié)膜組織進(jìn)行PAS染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，可見正常對照組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞排列規(guī)則，杯狀細(xì)胞形態(tài)完好，均勻地分布在上皮細(xì)胞間；干眼模型組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少且排列紊亂，杯狀細(xì)胞密度明顯減少；秦皮治療組大鼠結(jié)膜上皮細(xì)胞未見明顯異常，杯狀細(xì)胞密度較正常稍微減少（圖3）。

圖3 3組大鼠第28 d結(jié)膜組織PAS染色圖3A正常對照組，杯狀細(xì)胞（黑色箭頭）分布均勻，形態(tài)完整；3B干眼模型組，杯狀細(xì)胞計數(shù)明顯減少；3C秦皮治療組，杯狀細(xì)胞（黑色箭頭）計數(shù)未見明顯減少

各組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量比較：第28 d，干眼模型組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量(83.9±20.7)個較正常對照組(175.9±33.1)個明顯減少；而秦皮治療組結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量(126.2±29.1)個多于干眼模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.598，P=0.000)。

2.4 CD4+T細(xì)胞的數(shù)量

本研究通過觀察免疫熒光染色法檢測CD4+T細(xì)胞在角膜中的浸潤情況，從而反映眼表的炎癥程度。實驗發(fā)現(xiàn)，干眼模型組的大鼠角膜CD4+T細(xì)胞浸潤明顯，而秦皮治療組未見明顯的CD4+T細(xì)胞浸潤情況（圖4）。

圖4 3組大鼠第28 d角膜免疫熒光染色圖4A正常對照組，CD4＋T細(xì)胞（橘紅色）浸潤可忽略；4 B干眼模型組，CD4＋T細(xì)胞（橘紅色）浸潤顯著；4C秦皮治療組，CD4＋T細(xì)胞（橘紅色）浸潤較干眼模型組少

用藥后28 d，干眼模型組大鼠的每張角膜切片中CD4+T細(xì)胞數(shù)量為（98.6±21.7)個，較正常對照組的CD4+T細(xì)胞數(shù)量(35.2±9.5)個明顯增多；而秦皮治療組角膜CD4+T細(xì)胞數(shù)量為(63.4±11.2)個，少于干眼模型組，3組組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=88.229，P=0.000)。

3 討論

目前已經(jīng)明確了炎癥與干眼的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，基于眼表組織的免疫性炎癥是干眼最本質(zhì)的病理生理改變，目前不少學(xué)者致力于中藥的免疫調(diào)節(jié)研究，認(rèn)為可以通過減少炎性細(xì)胞因子釋放，減緩杯狀細(xì)胞凋亡發(fā)揮中藥治療干眼的作用[6-8]。現(xiàn)代藥理研究表明，秦皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、抗腫瘤、抗凝、抗過敏、抗氧化和清除自由基及止咳平喘、利尿、止汗等作用，其毒性較低而無致突變作用[9]。秦皮中抑制病原微生物的有效成分主要為秦皮甲素和秦皮乙素，各時段不同研究表明秦皮對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、變形桿菌、福氏痢疾桿菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等多種致病菌均有不同程度的抑制作用[10]，秦皮水煎醇沉后制成的浸液具有抗單純皰疹病毒的作用[11]。其抗炎鎮(zhèn)痛作用主要通過降低一氧化氮和可溶性細(xì)胞間黏附分子的分泌[12]及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、前列腺素水平等調(diào)節(jié)達(dá)成。冰片具有開竅醒神，清熱散毒，明目退翳之功效，常為佐使之用，《本草衍義》[13]稱之為“獨行則勢弱，佐使則有功”。樊嵐嵐等[14]通過離體兔眼角膜實驗對冰片的促滲作用進(jìn)行了分子水平研究，證實了冰片能夠通過增加角膜上皮的通透性而有效促進(jìn)滴眼液中成分進(jìn)入前房。故對于穿透角膜能力較弱的藥物，可予以加入一定濃度的冰片而使藥物快速進(jìn)入前房發(fā)揮治療作用。

本研究通過改裝冷風(fēng)機(jī)、隔熱材料、防潮材料、密封材料及控溫機(jī)等建立溫控模型房，成功模擬了單純環(huán)境因素誘導(dǎo)的大鼠干眼模型。研究結(jié)果表明處于干燥低濕、高氣流量環(huán)境中的Balb/c大鼠出現(xiàn)了與干眼患類似的臨床表現(xiàn)，造模成功。

各種類型的干眼均會造成杯狀細(xì)胞的損失，杯狀細(xì)胞一旦損失，由其分泌的凝膠粘蛋白MUC5AC表達(dá)水平自然下降[15-16]，從而引起淚膜穩(wěn)定性下降及加快眼表水樣液蒸發(fā)，降低淚液的潤滑作用，并促發(fā)引起眼表損害和炎癥。隨著干眼的發(fā)展，干燥應(yīng)力誘導(dǎo)了一個基于免疫的持續(xù)低度眼表炎癥，炎癥引起眼表CD4+T細(xì)胞和CD11b+單核細(xì)胞招募和激活并分泌各種炎性細(xì)胞因子[17-18]，實驗的干眼模型組CD4+T細(xì)胞免疫熒光染色也表現(xiàn)出了明顯的浸潤情況，而秦皮治療組CD4+T細(xì)胞浸潤情況明顯好轉(zhuǎn)，顯示炎癥減少。本次實驗通過CD4+T細(xì)胞的檢測論證秦皮滴眼液對于干眼眼表炎癥的抑制作用，為后續(xù)深入的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。