尹磊，劉偉，胡玉燕，蔣涵，錢(qián)暉(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院&檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可通過(guò)直接接觸或旁分泌作用促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。2009年，本課題組首先從人胃癌組織中分離培養(yǎng)出胃癌MSCs(gastric-cancer-derived MSCs，GC-MSCs)[1]，并發(fā)現(xiàn)GC-MSCs高表達(dá)Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein1,YAP1)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成[2]。此外，GC-MSCs可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞遷移、分化，并促進(jìn)胃癌進(jìn)展[3]。Wnt/β-catenin信號(hào)在胃癌中常異?；罨?，可促進(jìn)胃癌進(jìn)展，是胃癌治療的重要靶點(diǎn)之一。Yang等[4]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01133可吸附miR-106a-3p，拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制胃癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前尚不清楚GC-MSCs能否活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而影響胃癌的進(jìn)展。本研究旨在探討GC-MSCs對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，以期為胃癌治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器 人胃癌細(xì)胞系HGC-27購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基、Alexa Fluor 555標(biāo)記山羊抗兔多克隆IgG(美國(guó)Invitrogen公司)；胎牛血清、L-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)試劑盒(美國(guó)Cyagen公司)；兔抗人β-catenin抗體、兔抗人CD44抗體(美國(guó)Cell Signaling Technolog公司)；兔抗人CyclinD3抗體、兔抗人β-actin抗體(美國(guó)Bioworld Technology公司)；山羊抗兔多克隆IgG抗體(上?？党缮锕?；Wnt/β-catenin信號(hào)抑制劑ICG001(美國(guó)Selleck公司)；結(jié)晶紫、Hoechst 33342染料(美國(guó)Sigma公司)；Tirton X-100、多聚甲醛(上海國(guó)藥集團(tuán))；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF(美國(guó)Vazyme公司)；BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)；牛血清清蛋白(BSA，上海羅氏制藥公司)。0.22 μm濾器、PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；Transwell遷移小室(美國(guó)Corning公司)；Loading buffer、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)、DeltaVisionTMElite顯微鏡(美國(guó)GE公司)；倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2GC-MSCs原代培養(yǎng) 收集2018年9月至2019年9月于鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院普外科就診并行手術(shù)治療的胃癌患者7例，男4例，女3例，年齡65～82歲，中位年齡76歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理經(jīng)組織學(xué)明確診斷為胃癌；術(shù)前未行放、化療或其他抗腫瘤治療；未并發(fā)其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾患。排除標(biāo)準(zhǔn)：近半年使用免疫抑制劑或激素類(lèi)藥物患者；合并嚴(yán)重臟器功能不全者。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2012258)，患者知情同意。按本團(tuán)隊(duì)已建立的方法體外分離培養(yǎng)GC-MSCs[1]，即新鮮胃癌組織在無(wú)菌環(huán)境下剪切成1～3 mm3的組織塊，添加L-DMEM培養(yǎng)液(L-DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清)于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天換1次液。當(dāng)貼壁的GC-MSCs呈旋渦狀生長(zhǎng)時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，取第3～5代的GC-MSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3GC-MSC成骨分化 取第3代GC-MSCs以1.5×105/孔的細(xì)胞密度接種于預(yù)先包被明膠(0.1%)的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)GC-MSC融合度達(dá)70%時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換1次液，誘導(dǎo)14～20 d；待胞中出現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)后，用4%中性甲醛溶液固定30 min，茜素紅S染色5 min，倒置顯微鏡下觀察，成骨細(xì)胞含鈣可被染成橘紅色。

1.4GC-MSC成脂分化 取第3代GC-MSCs以1.5×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天換1次液，當(dāng)GC-MSC融合度達(dá)100%時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)A液培養(yǎng)；A液誘導(dǎo)3 d后，更換成脂誘導(dǎo)B液培養(yǎng)24 h；A液及B液交替誘導(dǎo)4～5次后(16～20 d)，B液維持培養(yǎng)3～6 d，每3天換1次液，光學(xué)顯微鏡下(×40)細(xì)胞中可見(jiàn)棕黃色脂滴時(shí)，誘導(dǎo)分化結(jié)束；4%中性甲醛溶液固定30 min；油紅O染液染色30 min；倒置顯微鏡下觀察，脂肪細(xì)胞中的脂滴可被染成紅棕色。

1.5GC-MSC上清收集 取第3～5代生長(zhǎng)良好的GC-MSCs，加入L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清，1 000×g離心10 min，0.22 μm濾器過(guò)濾后，置于-80 ℃凍存。

1.6克隆形成試驗(yàn) 取HGC-27細(xì)胞以2×103/孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)設(shè)為Control組(L-DMEM培養(yǎng)液)、GC-MSC組(GC-MSC上清)、GC-MSC+ICG001組(GC-MSC上清及20 μmol/L ICG001)處理24 h，更換為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d；4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，拍照，以肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落為單個(gè)克隆。

1.7Transwell遷移試驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HGC-27細(xì)胞以2×105/孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照1.6方法設(shè)為Control組、GC-MSC組、GC-MSC+ICG001組3組，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基；取200 μL細(xì)胞懸液(含8×104個(gè)細(xì)胞)加入Transwell上室，下室加入600 μL RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；棉簽拭去上室上表面未遷移的細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定上室下表面的細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色15 min；倒置顯微鏡下觀察，發(fā)生遷移的細(xì)胞可被染成藍(lán)色，隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.8免疫熒光染色 無(wú)菌環(huán)境下取細(xì)胞爬片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以2×104/孔的細(xì)胞密度接種HGC-27細(xì)胞，細(xì)胞分組、處理同1.6；4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入40 g/L多聚甲醛溶液室溫固定30 min；4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，每次5 min；加入0.1% Tirton X-100破膜10 min，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，每次5 min；50 mg/mL BSA溶液封閉30 min后，加入50 mg/mL BSA溶液稀釋的兔抗人β-catenin抗體(1∶100稀釋)4 ℃溫育12 h；用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌4次，每次5 min；加入PBS稀釋的Alexa Fluor 555標(biāo)記山羊抗兔多克隆IgG抗體(1∶250稀釋)，37 ℃避光溫育40 min；避光下PBS洗滌5次，每次5 min；室溫避光下Hoechst 33342染料(1∶300稀釋)染核5 min，PBS洗滌2次，每次5 min；取出細(xì)胞爬片，封片，DeltaVisionTMElite顯微鏡下拍攝(×600)，以紅色熒光表示為β-catenin表達(dá)，藍(lán)色表示為胞核。

1.9western blot HGC-27細(xì)胞種板、分組、處理同1.5；3組細(xì)胞經(jīng)蛋白裂解液(100 μL RIPA裂解液加1 μL PMSF)冰上裂解45 min；12 000×g離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；加入蛋白質(zhì)上清體積1/3的Loading buffer，混勻，沸水煮10 min，分裝。配制12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)上樣(100 μg)，80 V電泳直至目的蛋白質(zhì)完全分離，350 mA恒流轉(zhuǎn)膜75 min；PVDF膜置于50 mg/mL脫脂奶粉中封閉1.5 h，加入50 mg/mL BSA稀釋的兔抗人β-catenin抗體、兔抗人CD44抗體(均為1∶800稀釋)，兔抗人CyclinD3抗體(1∶500稀釋)、兔抗人β-actin抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃溫育過(guò)夜；1×TBST溶液洗滌6次，每次5 min；1×TBST溶液稀釋的山羊抗兔多克隆IgG抗體(1∶2 000稀釋)37 ℃溫育45 min；1×TBST溶液洗滌6次，每次5 min；采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)曝光、分析。

2 結(jié)果

2.1GC-MSCs的鑒定 人胃癌組織培養(yǎng)10 d后，可見(jiàn)長(zhǎng)梭形的GC-MSCs貼壁生長(zhǎng)(圖1A)。GC-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可見(jiàn)橘紅色的成骨細(xì)胞，提示GC-MSCs具備成骨分化潛能(圖1B)。GC-MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，胞內(nèi)可見(jiàn)紅棕色脂肪滴，表明GC-MSCs具備成脂分化潛能(圖1C)。

注：A，GC-MSCs的形態(tài)(×40)；B，GC-MSCs成骨誘導(dǎo)分化(×100)；C，GC-MSCs成脂誘導(dǎo)分化(×200)。

圖1 GC-MSCs的光學(xué)顯微鏡下鑒定結(jié)果

2.2GC-MSCs促進(jìn)胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移并活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路 克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，GC-MSC上清誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞增殖，其形成的細(xì)胞克隆數(shù)[(203.700±8.762)個(gè)]顯著高于Control組[(33.670±1.856))個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.98，P<0.01)。見(jiàn)圖2A。Transwell遷移試驗(yàn)結(jié)果表明，GC-MSC組[(349.700±7.881)個(gè)]遷移細(xì)胞數(shù)較Control組[(145.000±3.712)個(gè)]顯著增多(t=23.46，P<0.01)，見(jiàn)圖2B。GC-MSC上清可誘導(dǎo)HGC-27胞核高表達(dá)β-catenin蛋白(圖2C)，并促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游蛋白CD44及CyclinD3表達(dá)(圖2D)。

注：GC-MSC上清處理HGC-27細(xì)胞；A，克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；B，Transwell遷移試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移(×100)；C，免疫熒光染色檢測(cè)HGC-27細(xì)胞β-catenin的表達(dá)(×600)；D，western blot檢測(cè)HGC-27細(xì)胞β-catenin、CD44及CyclinD3蛋白的表達(dá)。

圖2 GC-MSCs促進(jìn)HGC-27細(xì)胞增殖、遷移并活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路

2.3GC-MSCs活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)HGC-27增殖、遷移 結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑ICG001可抑制GC-MSC上清誘導(dǎo)的HGC-27細(xì)胞β-catenin核輸入(圖3A)及CD44、CyclinD3(圖3B)的高表達(dá)。與GC-MSC組[(203.000±3.606)個(gè)]相比，GC-MSC+ICG001組HGC-27細(xì)胞增殖形成的克隆數(shù)[(70.667±2.603)個(gè)]顯著減少(q=39.24，P<0.01)，見(jiàn)圖3C。此外，GC-MSC+ICG001組遷移細(xì)胞數(shù)[(166.000±3.215)個(gè)]較GC-MSC組[(352.700±4.096)個(gè)]顯著降低(q=47.73，P<0.01)，見(jiàn)圖3D。

注：GC-MSCs上清單獨(dú)或聯(lián)合Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑ICG001(20 μmol/L)處理HGC-27細(xì)胞;A，免疫熒光染色檢測(cè)HGC-27細(xì)胞β-catenin的表達(dá)(×600)；B，western blot檢測(cè)HGC-27細(xì)胞β-catenin、CD44及CyclinD3蛋白的表達(dá)；C，克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)HGC-27細(xì)胞增殖；D，Transwell遷移試驗(yàn)檢測(cè)HGC-27細(xì)胞遷移(×100)。

圖3 GC-MSCs激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)HGC-27增殖、遷移

3 討論

MSCs可自發(fā)地向腫瘤部位募集，參與腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成。MSCs遷移至腫瘤微環(huán)境后可與腫瘤微環(huán)境中的其他非腫瘤細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞向促瘤表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一[5]。GC-MSCs可促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，但GC-MSCs促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制目前尚不清楚。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)，GC-MSC上清可抑制TH17細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化，破壞Treg/TH17細(xì)胞間的平衡，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化(EMT)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)胃癌肝轉(zhuǎn)移。Sun等[7]證實(shí)，GC-MSC上清中富含IL-15,可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5(signal transducer and activator of transcription,STAT5)表達(dá)，促進(jìn)胃癌進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，GC-MSC上清可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移。以上提示GC-MSCs可通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)胃癌進(jìn)展。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌中異?；罨?，可促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[4]。旁分泌是Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化的主要方式之一。我們推測(cè)GC-MSCs可通過(guò)旁分泌作用，活化胃癌Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，GC-MSCs誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞β-catenin蛋白及Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游蛋白CD44及CyclinD3表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑ICG001可抑制GC-MSCs對(duì)HGC-27細(xì)胞的促增殖和促遷移作用。

目前尚不清楚GC-MSCs是如何活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路而促進(jìn)胃癌進(jìn)展?？赡艿臋C(jī)制為：(1)MSCs相比非腫瘤細(xì)胞其β-catenin表達(dá)水平更高，β-catenin可經(jīng)微囊泡遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)[8]，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，誘導(dǎo)下游分子c-myc、金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)，促進(jìn)胃癌進(jìn)展；(2)GC-MSCs可分泌Wnt1、Wnt5a、Wnt3a等到上清液中，這些分子可與腫瘤細(xì)胞表面的Wnt受體相互作用，活化Wnt/β-catenin信號(hào)；(3)GC-MSCs可分泌一些非編碼RNA如miRNA-25，抑制Wnt/β-catenin通路拮抗基因DKK3的表達(dá)，活化Wnt信號(hào)。未來(lái)，可通過(guò)調(diào)控GC-MSC Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子的表達(dá)，拮抗胃癌Wnt/β-catenin通路,從而抑制胃癌進(jìn)展。