全細(xì)胞催化甘油生物合成L-果糖體系的構(gòu)建

陳 洲， 秦 嶺， 李 芬， 李子杰， 高曉冬

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 江蘇 無錫 214122)

稀少糖是指在自然界中含量極低且具有重要生理功能的一類單糖及其衍生物[1-2]。隨著人們生活水平的提高，高糖攝入引起的糖尿病、高血壓和心血管病等，嚴(yán)重危害著人類的生命健康[3]。稀少糖在膳食與健康領(lǐng)域具有重要的生理功能，逐漸被人們熟知[4-5]。L-果糖作為稀少糖的一種，是D-果糖的對映異構(gòu)體，在理化性質(zhì)方面，L-果糖與D-果糖幾乎相同，如外觀、甜度、熔沸點以及與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)等特性；但在生化性質(zhì)方面有著較大差異，例如，L-果糖低熱量，是一種低能量的甜味劑[6]，也是多種糖苷酶的抑制劑[7]，是螞蟻和家蠅的殺蟲劑[8]。此外，L-果糖在合成具有生物活性的化合物方面具有潛在應(yīng)用價值[9-10]。由于這些獨特的性質(zhì)，L-果糖的合成一直都是當(dāng)今研究的熱門領(lǐng)域。目前，L-果糖主要通過化學(xué)法和酶法來合成，其中化學(xué)合成存在使用有毒物質(zhì)、收率低等問題，酶法存在酶提純步驟繁瑣，同時需要輔因子等弊端[11-14]，制約了其應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化擁有多種優(yōu)勢：能耗低、催化效率高、專一性強(qiáng)、生產(chǎn)操作條件簡單以及產(chǎn)物單一易分離等，此方法已被廣泛應(yīng)用于各種糖醇類的合成15-17]。在之前的工作中，本研究室已構(gòu)建好表達(dá)E型馬肝乙醇脫氫酶，特異性氧化甘油生成L-甘油醛，并應(yīng)用于L-果糖的合成[18]。但是，以上方法采用6種純酶一起反應(yīng)，需要2種底物(D/L-3磷酸甘油和甘油)，同時需要添加輔因子，操作過程繁瑣，不利于工業(yè)化的應(yīng)用。本研究采用2種細(xì)胞混合催化甘油合成L-果糖，首先，構(gòu)建表達(dá)E型馬肝乙醇脫氫酶(EE type horse liver alcohol dehydrogenase,HLADH-EE)和釀膿鏈球菌來源的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)的細(xì)胞菌株，以甘油為底物生成L-甘油醛，通過偶聯(lián)NOX，從而實現(xiàn)NAD+的合成與再生，無須額外添加輔因子NAD+；然后與表達(dá)大腸桿菌MG1655來源的甘油激酶(glycerol kinase,GK)、肺炎鏈球菌來源的甘油磷酸氧化酶(L-α-glycerophosphate oxidase,GPO)以及大腸桿菌MG1655來源的L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶(L-rhamnulose-1-phosphate aldolase,RhaD)和磷酸酶(fructose-1-phosphotase,YqaB)的菌株偶聯(lián)。新生成的L-甘油醛作為受體，在醛縮酶RhaD的作用下與磷酸二羥基丙酮(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)發(fā)生羥醛縮合生成L-果糖-1-磷酸，最后由磷酸酶脫去磷酸，生成L-果糖。全細(xì)胞生產(chǎn)操作條件簡單，無須繁瑣的酶純化過程；采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化以廉價的甘油為唯一底物，變廢為寶；同時不需要添加輔因子，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，可為L-果糖產(chǎn)品綠色生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1主要試劑和培養(yǎng)基

PCR所需試劑、限制性內(nèi)切酶以及連接酶Ligation Mix，寶生物(大連)有限公司；質(zhì)粒提取、純化試劑盒、抗生素，生工生物工程(上海)股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)、L-甘油醛、L-果糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich公司；甘油等其他試劑，國藥化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24，胰蛋白胨12，甘油5，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.4。

1.1.2菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)為本實驗室保存；質(zhì)粒pET28a由本實驗保藏；pCDFDuet-1由江南大學(xué)鄧禹教授饋贈；菌株BL-HN(含有pET28a-HLADH質(zhì)粒和pCDFDuet-nox質(zhì)粒)為本研究構(gòu)建；菌株BL-RB(含有pCDFDuet-rhaD-glpO-glpK質(zhì)粒和pET28a-yqaB質(zhì)粒)為本研究室前期構(gòu)建。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、SDS-PAGE型電泳儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司；臺式水平恒溫?fù)u床，江蘇太倉強(qiáng)樂實驗儀器有限公司；電子天平，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀(HPLC)、自動進(jìn)樣器、示差折光檢測器，美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1HLADH-EE和NOX的異源表達(dá)

質(zhì)粒pET28-HLADH的構(gòu)建信息已經(jīng)報道[18]。NADH氧化酶基因nox以釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)基因組為模板，采用如下引物擴(kuò)增：NOX-F：TATACATATGATGAGTAAAATCGTTGTTGT；NOX-R：CGCGCTCGAGGTCTTTGGCACCAAGTGCTGC，下劃線處為酶切位點，與pCDFDuet-1載體用NdeI和XhoI雙酶切，然后膠回收，連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，測序正確后與pET28-HLADH同時轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆接入5 mL含有50 mg/L的卡那霉素和鏈霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。次日，將上述培養(yǎng)基以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接含有相應(yīng)抗性的TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約0.8，加入一定量的IPTG，同時，轉(zhuǎn)移至適當(dāng)溫度的恒溫?fù)u床中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體通過SDS-PAGE進(jìn)行驗證。

1.3.2全細(xì)胞催化劑的制備

經(jīng)SDS-PAGE驗證后的菌液，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體。用預(yù)冷的生理鹽水洗滌菌體3次，然后將收集的菌體放置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3HLADH-EE活性檢測

將甘油(10 mmol/L)和BL-HN重組細(xì)胞(終質(zhì)量濃度100 g/L)，加入到50 mmol/L Tris-HCl(pH值為8.5)中，于35 ℃、180 r/min搖床反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，離心，收集上清；經(jīng)過0.22 μm濾膜除雜后，通過HPLC進(jìn)行測定。

1.3.4BL-HN菌株誘導(dǎo)條件優(yōu)化

目的蛋白的表達(dá)受諸多因素的影響，分別選取誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間以及IPTG的濃度進(jìn)行研究，通過HPLC測定L-甘油醛的生成量，確定最適條件。

誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：以16、20、30、37 ℃為溫度梯度，將培養(yǎng)的種子以體積分?jǐn)?shù)1%接種到50 mL的TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，20 h后，取等量的細(xì)胞，測定35 ℃下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化10 mmol/L甘油生成L-甘油醛的量。

誘導(dǎo)時間優(yōu)化：將培養(yǎng)的種子以體積分?jǐn)?shù)1%接種到50 mL的TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，在20 ℃下分別誘導(dǎo)16、20、24、28 h。取等量的細(xì)胞，測定35 ℃下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化10 mmol/L甘油生成L-甘油醛的量。

IPTG濃度優(yōu)化：設(shè)定IPTG的濃度為0.01、0.05、0.1、0.2 mmol/L 4個梯度。將培養(yǎng)的種子以體積分?jǐn)?shù)1%接種到50 mL的TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約0.8，加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，在20 ℃下分別誘導(dǎo)16 h。取等量的細(xì)胞，測定35 ℃下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化10 mmol/L甘油生成L-甘油醛的量。

條件優(yōu)化實驗采用相對活性進(jìn)行表征，其中相對活性的定義為：相同細(xì)胞量的情況下，以L-甘油醛的生成量最高的條件為100%，其他條件下L-甘油醛的生成量與之相比較，所得的比值稱為相對活性，用以表征BL-HN菌株活性。

1.3.5全細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油合成L-果糖的條件優(yōu)化

為了探究反應(yīng)條件對全細(xì)胞合成L-果糖的影響，選取溫度、pH值、濕細(xì)胞質(zhì)量濃度、甘油濃度進(jìn)行研究。因菌株BL-RB在外加L-甘油醛的條件下?lián)碛泻芎玫厣a(chǎn)L-果糖的能力[19]，首先，在菌株BL-RB濕細(xì)胞質(zhì)量濃度為150 g/L保持不變時，對BL-HN的濕細(xì)胞濃度進(jìn)行優(yōu)化。選取BL-HN的濕細(xì)胞質(zhì)量濃度為10、25、50、100和200 g/L進(jìn)行研究，測定35 ℃，pH值8.5下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化200 mmol/L甘油生成L-果糖的量。在2種細(xì)胞優(yōu)化比例的條件下，又分別考察了溫度、pH值以及甘油濃度等因素對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成L-果糖的影響。對溫度設(shè)置25、30、35、40、45 ℃等5個梯度，對pH值設(shè)置7.5、8.0、8.5、9.0、9.5等5個梯度，對甘油的濃度設(shè)置100、200、300、400、500、600 mmol/L等6個梯度，通過HPLC測定L-果糖的生成量，確定較適轉(zhuǎn)化條件。

濕細(xì)胞質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度以及pH值的優(yōu)化采用相對活性進(jìn)行實驗結(jié)果表征，其中相對活性的定義為：以L-果糖生成量最高的條件為100%，其他條件下L-果糖的生成量與之相比較，所得的比值稱為相對活性，用以表征BL-HN菌株活性。

1.3.6甘油合成L-果糖的測定

在優(yōu)化反應(yīng)條件下，將反應(yīng)體系擴(kuò)大為10 mL，甘油(500 mmol/L)，重組細(xì)胞BL-HN(25 g/L)，重組細(xì)胞BL-RB(150 g/L)，加入50 mmol/L Tris-HCl (pH值9.0) 的緩沖液中，于30 ℃、180 r/min搖床反應(yīng)36 h。通過HPLC測定L-果糖的生成量。

1.4 色譜條件

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成的L-甘油醛和L-果糖通過HPLC進(jìn)行檢測。HPLC條件色譜柱：伯樂有機(jī)酸柱(Aminex HPX-87H, 300 mm×7.8 mm)；流動相：5 mmol/L稀硫酸；流速：0.5 mL/min；檢測器：示差折光檢測器；柱溫：60 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HLADH-EE和NOX的蛋白表達(dá)及活性分析

BL-HN菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過SDS-PAGE進(jìn)行驗證(見圖1)。由圖1可知，通過誘導(dǎo)前后菌體對比發(fā)現(xiàn)，約在43 kDa和50 kDa處明顯出現(xiàn)特征蛋白條帶，這與HLADH-EE(43 kDa)和NOX(49.6 kDa)相符，說明HLADH-EE和NOX均成功表達(dá)。通過誘導(dǎo)后的菌體與誘導(dǎo)后的上清液相比，HLADH-EE和NOX的蛋白表達(dá)量沒有明顯減少，說明HLADH-EE和NOX均是可溶性蛋白。當(dāng)重組蛋白發(fā)生錯誤折疊時，往往會形成沉淀，影響酶活力，這間接地說明以上2種蛋白折疊正確。

圖1 HLADH-EE和NOX的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of HLADH-EE and NOX

圖2 全細(xì)胞反應(yīng)液中L-甘油醛的HPLC分析Fig.2 HPLC detection of L-glyceraldehyde in whole-cell reaction mixture

采用全細(xì)胞以甘油為底物進(jìn)行活性驗證，經(jīng)過12 h的反應(yīng)，離心，收集上清；過膜除雜后，通過HPLC進(jìn)行測定(見圖2)。由圖2可知，與L-甘油醛標(biāo)樣相比，此菌株成功催化甘油合成L-甘油醛。HLADH-EE是NAD+依賴型脫氫酶，純酶反應(yīng)中，輔因子NAD+是必需的。因細(xì)胞內(nèi)部含有少量輔因子NAD+，所以采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化無須額外添加NAD+即可成功得到L-甘油醛。這說明此菌株可實現(xiàn)輔因子的再生， 節(jié)約生產(chǎn)成本。

2.2 L-果糖合成路徑的構(gòu)建

菌株BL-HN催化甘油生成L-甘油醛，新生成的L-甘油醛進(jìn)入BL-RB細(xì)胞內(nèi)。BL-RB細(xì)胞催化甘油生成DHAP，在RhaD的作用下，L-甘油醛與DHAP發(fā)生羥醛縮合生成L-果糖-1-磷酸，經(jīng)YqaB脫磷酸作用，生成L-果糖(見圖3)。

HLADH：馬肝乙醇脫氫酶；NOX：NADH氧化酶；GK：甘油激酶；GPO：甘油磷酸氧化酶；catalase：過氧化氫酶；RhaD：L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶；YqaB：磷酸酶。圖3 全細(xì)胞催化甘油合成L-果糖路徑Fig.3 Synthesis of L-fructose by whole-cell biocatalysis from glycerol

BL-HN細(xì)胞和BL-RB細(xì)胞1∶1混合以甘油為底物，進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)合成L-果糖。在前期工作中，已經(jīng)對BL-RB菌株中各種酶(GK, GPO, RhaD和YqaB)的表達(dá)和活性進(jìn)行驗證[19](見圖4)。由圖4可知，與L-果糖標(biāo)樣相比，全細(xì)胞反應(yīng)液中有L-果糖的生成。說明利用2種細(xì)胞共同催化甘油合成L-果糖的方法是可行的。與純酶體系相比，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化優(yōu)勢明顯，無須添加輔因子NAD+，僅要一種底物甘油即可合成L-果糖，并且在降低生產(chǎn)成本的同時也為甘油的變廢為寶提供了一個方向。

圖4 全細(xì)胞反應(yīng)液中L-果糖的HPLC分析Fig.4 HPLC detection of L-fructose in whole-cell reaction mixture

2.3 BL-HN菌株誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果

真核來源的E型馬肝乙醇脫氫酶HLADH-EE對誘導(dǎo)條件要求相對較高，通過大腸桿菌異源表達(dá)具有挑戰(zhàn)性，菌體生長過快、蛋白表達(dá)量過多等因素均可導(dǎo)致HLADH-EE失活。如溫度過高，菌體生長快，蛋白的表達(dá)量增多，增多的蛋白來不及正確折疊，進(jìn)而影響酶活，因此對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化很有必要。

2.3.1誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

將培養(yǎng)的種子液以體積分?jǐn)?shù)1%接種到50 mL的TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，以16、20、30、37 ℃為溫度梯度進(jìn)行誘導(dǎo)，20 h后，取等量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化10 mmol/L甘油，對L-甘油醛的生成量進(jìn)行測定(見圖5)。由圖5可知，低溫有利于酶的表達(dá)，這與較低溫度時菌體對比生長速率較低、質(zhì)粒穩(wěn)定性好、外源蛋白的穩(wěn)定性和可溶性提高等有著密切關(guān)系。但是，當(dāng)溫度過低時，營養(yǎng)物的攝入和生長速率降低，菌體營養(yǎng)不良，不利于外源蛋白的形成。誘導(dǎo)溫度為20 ℃，此時相對活性最高，故選取20 ℃為下一次優(yōu)化實驗的較適溫度。

圖5 誘導(dǎo)溫度對全細(xì)胞合成L-甘油醛的影響Fig.5 Effect of induced temperature on whole-cell biocatalysis of L-glyceraldehyde

2.3.2誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

當(dāng)OD600約0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG在20 ℃下分別誘導(dǎo)16、20、24、28 h。取等量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化10 mmol/L甘油，對L-甘油醛的生成量進(jìn)行測定(見圖6)。由圖6可知，誘導(dǎo)時間對合成L-甘油醛的影響相對較??；但是，誘導(dǎo)時間過久，菌體老化、次級代謝產(chǎn)物增多等均會對外源蛋白的表達(dá)及活性造成影響。最適誘導(dǎo)時間為16 h，此時相對活性最高，故選取16 h為下一次優(yōu)化實驗的較適時間。

圖6 誘導(dǎo)時間對全細(xì)胞合成L-甘油醛的影響Fig.6 Effect of induction time on whole-cell biocatalysis of L-glyceraldehyde

2.3.3誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

當(dāng)OD600約0.8，在20 ℃下分別加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，在20 ℃下分別誘導(dǎo)16 h。取等量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化10 mmol/L甘油，對L-甘油醛的生成量進(jìn)行測定。誘導(dǎo)劑的量往往與誘導(dǎo)蛋白的量呈現(xiàn)正相關(guān)，若外源蛋白對菌體本身有毒性，大量的外源蛋白表達(dá)會抑制菌體的生長，因此對誘導(dǎo)劑進(jìn)行優(yōu)化很有必要(見圖7)。由圖7可知，高濃度的誘導(dǎo)劑不利于外源蛋白的表達(dá)，原因可能是過量表達(dá)的外源蛋白影響了菌體的正常生長。較適誘導(dǎo)劑濃度為0.05 mmol/L IPTG，此時相對活性最高，故選取0.05 mmol/L IPTG為較適添加量。

圖7 誘導(dǎo)劑濃度對全細(xì)胞合成L-甘油醛的影響Fig.7 Effect of IPTG concentration on whole-cell biocatalysis of L-glyceraldehyde

綜上所述，BL-HN菌株誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果如下：誘導(dǎo)溫度為20 ℃，誘導(dǎo)時間為16 h，誘導(dǎo)劑濃度為0.05 mmol/L IPTG。探究誘導(dǎo)條件對重組酶的影響，將有助于提高外源蛋白的穩(wěn)定性與可溶性。

2.4 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1菌株BL-HN的濕細(xì)胞質(zhì)量濃度的優(yōu)化

圖8 BL-HN細(xì)胞量對L-果糖生成的影響Fig.8 Effect of wet cell amounts on formation of L-fructose

L-果糖的合成體系分2步進(jìn)行：第一步，HLADH-EE轉(zhuǎn)化甘油生成L-甘油醛；第二步，醛縮酶(RhaD)接受L-甘油醛為受體合成L-果糖。因此，優(yōu)化2種細(xì)胞的比例，對協(xié)同合成L-果糖是必要的。菌株BL-RB濕細(xì)胞質(zhì)量濃度為150 g/L保持不變，我們對BL-HN的濕細(xì)胞質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，選取BL-HN的濕細(xì)胞質(zhì)量濃度為10、25、50、100和200 g/L進(jìn)行研究，在35 ℃，pH值為8.0下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化200 mmol/L甘油，對L-果糖的生成量進(jìn)行測定(見圖8)。由圖8可知，隨著細(xì)胞質(zhì)量濃度的提高，相對活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)BL-HN的細(xì)胞質(zhì)量濃度較低時，產(chǎn)生的L-甘油醛較少，因此L-果糖的產(chǎn)量低，導(dǎo)致相對活性低；但是，當(dāng)BL-HN的細(xì)胞質(zhì)量濃度≥50 g/L時，產(chǎn)生的L-甘油醛過多，高濃度的L-甘油醛會抑制醛縮酶RhaD的活性，導(dǎo)致L-果糖的產(chǎn)量下降，相對活性降低。BL-HN最適細(xì)胞質(zhì)量濃度為50 g/L，此時L-果糖產(chǎn)量最高，故選取50 g/L為下一次優(yōu)化實驗的較適細(xì)胞質(zhì)量濃度。

2.4.2溫度優(yōu)化

全細(xì)胞反應(yīng)，歸根結(jié)底是酶的反應(yīng)，通常酶的催化作用隨溫度升高而加速，但溫度升高到一定限度后，酶的活性就要鈍化，直至完全失活，因此對溫度進(jìn)行優(yōu)化是必要的。溫度設(shè)置25、30、35、40、45 ℃ 5個梯度，在pH值為8.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，添加200 mmol/L甘油為底物和50 g/L的BL-HN濕細(xì)胞以及150 g/L的BL-RB濕細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。12 h后測定不同溫度下產(chǎn)物L(fēng)-果糖的生成量(見圖9)。由圖9可知，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化對溫度的適應(yīng)性較好，當(dāng)反應(yīng)溫度為45 ℃時，其相對活性仍有70%左右，說明細(xì)胞膜對酶有很好的保護(hù)作用；在35 ℃的條件下，L-果糖相對活性最高，故選取35 ℃為下一次優(yōu)化實驗的較適溫度。

圖9 反應(yīng)溫度對L-果糖生成的影響Fig.9 Effect of temperature on formation of L-fructose

2.4.3pH值優(yōu)化

pH值可以改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶和底物的結(jié)合，過高或過低的pH值都會影響酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而使酶遭受不可逆破壞。因此，對pH值進(jìn)行優(yōu)化也是必要的。配置pH值為7.5～9.5的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，在35 ℃，200 mmol/L甘油為底物，50 g/L的BL-HN濕細(xì)胞和150 g/L的BL-RB濕細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。12 h后測定不同pH值下的L-果糖的生成量(見圖10)。由圖10可知，堿性條件更適合此全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，但是高pH值對L-果糖的產(chǎn)量影響很大。當(dāng)pH值過高時，大腸桿菌的細(xì)胞膜容易裂解，導(dǎo)致胞內(nèi)酶直接暴露在高pH值的緩沖液中，而醛縮酶RhaD在高pH值的條件下，酶活力低，從而引起L-果糖產(chǎn)量下降。在pH=9.0的條件下，L-果糖相對活性最高，故選取pH=9.0為較適反應(yīng)的pH值。

圖10 pH值對L-果糖生成的影響Fig.10 Effect of pH on formation of L-fructose

2.4.4甘油的濃度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

底物濃度對酶的活性不產(chǎn)生影響，對酶促反應(yīng)速率產(chǎn)生影響。隨著底物濃度增加，酶促反應(yīng)速率逐漸加快，單位時間產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。設(shè)置甘油的濃度為100、200、300、400、500、600 mmol/L 6個梯度，在pH=9.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，添加不同濃度的甘油為底物和50 g/L的BL-HN濕細(xì)胞以及150 g/L的BL-RB濕細(xì)胞，在35 ℃條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)。12 h后測定L-果糖的生成量(見圖11)。由圖11可知，在35 ℃的條件下，L-果糖產(chǎn)量最高，為2.52 g/L。與100 mmol/L甘油底物相比，當(dāng)甘油濃度提高到400、500和600 mmol/L時，L-果糖的產(chǎn)量分別提高至9.8、10.7和10.9倍；當(dāng)甘油濃度≤500 mmol/L時，提升甘油濃度對L-果糖的產(chǎn)量影響顯著。但是，繼續(xù)提高甘油濃度到600 mmol/L時，L-果糖的產(chǎn)量僅為2.52 g/L，相較500 mmol/L甘油，產(chǎn)量提升并不明顯，因此推測底物甘油已經(jīng)飽和，產(chǎn)物L(fēng)-果糖不再隨著甘油濃度的增加而明顯提高。

圖11 甘油濃度對L-果糖生成的影響Fig.11 Effect of glycerol concentration on formation of L-fructose

綜上所述，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化較適反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量濃度50 g/L的BL-HN濕細(xì)胞以及150 g/L的BL-RB濕細(xì)胞，較適反應(yīng)溫度為35 ℃，較適反應(yīng)pH值為9.0，較適甘油濃度為500 mmol/L。

2.5 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取影響L-果糖產(chǎn)量的各因素中有意義的水平做正交試驗，對結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳的反應(yīng)條件。采用L9(34)正交表，以溫度(A)、pH(B)、BL-HN濕細(xì)胞質(zhì)量濃度(C)、甘油濃度(D)作為4個考察因素，選取3個水平進(jìn)行試驗(見表1)。

按表1的正交因素水平設(shè)計L9(34)正交試驗，結(jié)果見表2。

表1 全細(xì)胞合成L-果糖正交試驗因素水平表

表2 全細(xì)胞合成L-果糖正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表2的極差分析結(jié)果可以看出，RD>RB>RA>RC，4個因素對合成L-果糖的影響大小依次為：甘油濃度(D)>pH(B)>濕細(xì)胞質(zhì)量濃度(C)>溫度(A)。4個因素中，甘油濃度和pH值的影響較為顯著，其中，甘油濃度對合成L-果糖的影響最為顯著。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到全細(xì)胞合成L-果糖的優(yōu)化條件為A3B2C1D3，即溫度40 ℃、pH值為9.0、濕細(xì)胞質(zhì)量濃度25 g/L、甘油濃度500 mmol/L。

2.6 驗證實驗

按照優(yōu)化條件，進(jìn)行3次平行實驗，L-果糖的生成量分別為2.19、2.34、2.41 g/L，說明該優(yōu)化可行。

根據(jù)正交試驗結(jié)果可知，溫度對全細(xì)胞合成L-果糖的影響最小，故可考慮采用30 ℃進(jìn)行反應(yīng)。采用此條件，L-果糖的生成量分別為2.15、2.13、2.38 g/L。與正交試驗優(yōu)選出的較佳條件相比，L-果糖的生成量并沒有明顯降低，且反應(yīng)需求的溫度更低，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。

2.7 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油合成L-果糖產(chǎn)量分析

在溫度30 ℃、pH值為9.0、濕細(xì)胞質(zhì)量濃度25 g/L、甘油濃度500 mmol/L條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，連續(xù)反應(yīng)36 h，每隔12 h進(jìn)行取樣，然后測定L-果糖的生成量(見圖12)。由圖12可知，在反應(yīng)36 h時，L-果糖產(chǎn)量最高為2.67 g/L。延長轉(zhuǎn)化時間，產(chǎn)量增長緩慢，可能原因是隨著產(chǎn)物生成，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物速率下降，從而導(dǎo)致L-果糖產(chǎn)量增長緩慢。在反應(yīng)的過程中，12 h的樣品經(jīng)離心加熱后依然澄清，而36 h的樣品經(jīng)離心加熱后有絮狀沉淀出現(xiàn)。因此，推斷細(xì)胞膜在反應(yīng)的過程中發(fā)生了破損，細(xì)胞的內(nèi)容物流出，導(dǎo)致絮狀沉淀形成；失去了細(xì)胞膜的保護(hù)作用，胞內(nèi)酶活性受到影響，進(jìn)而影響L-果糖的產(chǎn)率。

圖12 全細(xì)胞催化甘油合成L-果糖的產(chǎn)量Fig.12 L-fructose yield from glycerol by whole-cell biocatalysis

3 結(jié) 論

本研究建立了全細(xì)胞催化甘油合成L-果糖生物轉(zhuǎn)化方法。構(gòu)建E型馬肝乙醇脫氫酶和NADH氧化酶的基因工程菌株，實現(xiàn)從甘油到L-甘油醛的合成，以全細(xì)胞作為催化劑催化該反應(yīng)，偶聯(lián)NOX，實現(xiàn)NAD+/NADH的合成與再生，解決添加輔因子的問題；并且對表達(dá)E型馬肝乙醇脫氫酶和NADH氧化酶的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確認(rèn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件。通過單因素實驗研究溫度、pH值、濕細(xì)胞質(zhì)量濃度、甘油濃度對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油合成L-果糖的影響，利用正交試驗得到優(yōu)化反應(yīng)條件。在優(yōu)化反應(yīng)條件下利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)連續(xù)轉(zhuǎn)化36 h，最終獲得L-果糖2.67 g/L。本研究采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法以廉價的甘油為原料生產(chǎn)L-果糖，不僅省去了繁瑣的酶純化步驟、無須添加輔因子，而且生產(chǎn)成本低廉。希望研究對L-果糖產(chǎn)品綠色生產(chǎn)及現(xiàn)有技術(shù)改造提供理論參考。