滅活型副干酪乳桿菌L9常溫酸奶調(diào)節(jié)腸道菌群緩解便秘作用研究

王 然， 李桂花， 王鵬杰， 劉 力， 劉治麟， 張 炎，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 營養(yǎng)與健康系， 北京 100083； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083； 3.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 廊坊 065201； 4.北京和益源生物技術(shù)有限公司， 北京 100089)

便秘是一種常見的功能性胃腸疾病，可導(dǎo)致腹痛、厭食、痔瘡和抑郁等疾病，在全球的發(fā)病率是14%[1-3]。目前，用于便秘的治療方法主要包括藥物和非藥物治療。藥物的治療效果有限，甚至?xí)a(chǎn)生依賴作用，一旦停止使用，便秘往往會(huì)復(fù)發(fā)，而且會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如頭痛、腹痛、惡心、腹瀉和心血管疾病等，會(huì)使治療的周期延長[4]；非藥物治療主要是生活方式的改變，包括體育鍛煉，調(diào)整飲食等[5]。

研究表明，益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群，產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，降低結(jié)腸的pH值和傳輸時(shí)間，從而促進(jìn)腸道蠕動(dòng)[6]。 服用益生菌已成為治療便秘的有效方法，但是活菌型益生菌在使用中仍然存在一些問題，如在免疫缺陷患者等弱勢人群使用時(shí)的不安全性[7],在胃腸道低pH值和蛋白酶豐富的環(huán)境中存活率低等[8]。滅活益生菌安全性高，沒有菌量限制，可與抗生素合用，其產(chǎn)品易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，具有較長的貨架期。滅活益生菌在日本、美國、俄羅斯和德國等國家得到廣泛研究和應(yīng)用，我國對(duì)于益生菌的研究多限于活菌，在滅活菌及其制品方面的研究還比較少[9-10]。滅活益生菌功能性的研究主要集中于調(diào)節(jié)免疫[11]、緩解過敏[12]和調(diào)節(jié)腸道菌群[13]等，其是否具有緩解便秘的作用尚缺乏研究。

副干酪乳桿菌L9分離自健康人腸道，具有調(diào)節(jié)免疫[14-15],增加小鼠腸道短鏈脂肪酸[16]和調(diào)節(jié)人體腸道菌群等益生功能[17]，其滅活菌是否具有緩解便秘的功能尚待研究。本研究擬通過人群實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)滅活型常溫副干酪乳桿菌L9酸奶對(duì)便秘人群癥狀的改善作用和調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，為含有滅活型乳酸菌產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及試驗(yàn)樣品

副干酪乳桿菌L9(簡稱L9)，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 9800；常溫酸奶和含滅活副干酪乳桿菌L9的常溫酸奶(簡稱L9常溫酸奶)樣品(200 g/瓶)，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌研究中心制備。

常溫酸奶制備方法：7%白砂糖與93%生牛乳經(jīng)過95 ℃，300 s殺菌后，添加嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(1×106CFU/mL)，43 ℃發(fā)酵5 h，80 ℃滅菌1 min，得到常溫酸奶實(shí)驗(yàn)樣品。

L9常溫酸奶制備方法：7%白砂糖與93%生牛乳經(jīng)過95 ℃，300 s殺菌后，添加嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(1×106CFU/mL)，并添加L9菌粉(1×108CFU/g)，43 ℃發(fā)酵5 h，80 ℃滅菌1 min，得到L9常溫酸奶實(shí)驗(yàn)樣品。

1.2 受試對(duì)象

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)

年齡18～65歲，每周排便3～4次，長期或間歇性便秘、大便不成形，排便次數(shù)不規(guī)律的受試者。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)

1)主訴不清者，體質(zhì)虛弱無法進(jìn)行試驗(yàn)者，孕期及哺乳期、經(jīng)期婦女。

2)30 d內(nèi)進(jìn)行過外科手術(shù)引起便秘癥狀發(fā)生者。

3)合并有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重全身疾病患者，便秘困難并伴有疼痛者，或有其他伴隨疾病正在治療者。

4)不能經(jīng)口進(jìn)食者或不能按規(guī)定服用受試樣品者。短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到結(jié)果的判斷者。

5)長期服用或?qū)嶒?yàn)開始前15 d內(nèi)服用抗生素類藥物者。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

計(jì)劃招募受試者60人，隨機(jī)分成常溫酸奶組和L9常溫酸奶組，盡可能考慮到影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、日常飲食、便秘原因等，每個(gè)年齡段人數(shù)盡量保持均衡，以保證組內(nèi)的可比性。經(jīng)過7 d排空期后，采集受試者糞便樣本，再連續(xù)飲用試驗(yàn)樣品28 d，每天飲用常溫酸奶或L9常溫酸奶1瓶，飲用期結(jié)束后采集受試者糞便樣本。試驗(yàn)期間，受試者每周填寫腸道健康調(diào)查表，其中包括排便情況、不良反應(yīng)等。試驗(yàn)期間不改變原來的飲食習(xí)慣，正常飲食。

1.4 觀察及檢測指標(biāo)

1.4.1觀察指標(biāo)

1)每日排便次數(shù)：受試者記錄每日排便次數(shù)的變化。

2)排便狀況：根據(jù)排便困難程度(腹痛或肛門燒灼感、下墜感、不適感，有否便頻但排便困難而量少等癥狀)分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，統(tǒng)計(jì)積分值。

Ⅰ級(jí)(0分)：排便正常。

Ⅱ級(jí)(1分)：僅有下墜感、不適感。

Ⅲ級(jí)(2分)：下墜感、不適感明顯，或有便頻但排便困難而量少，較少出現(xiàn)腹痛或肛門燒灼感。

Ⅳ級(jí)(3分)：經(jīng)常出現(xiàn)腹痛或肛門燒灼感，影響排便。

3)糞便性狀：根據(jù)布里斯托(Bristol)糞便性狀分類法將糞便性狀分為Ⅰ～Ⅲ 級(jí)。

Ⅰ級(jí)(0分)：像香腸或蛇，平滑而且軟；像香腸，但在它的表面有裂痕；軟的團(tuán)塊，有明顯的邊緣(容易排出)。

Ⅱ級(jí)(1分)：香腸形狀，但有團(tuán)塊；松散的塊狀，邊緣粗糙，像泥漿狀的糞便。

Ⅲ級(jí)(2分)：分離的硬團(tuán)，像果核(不易排出)。

1.4.2檢測指標(biāo)

1.4.2.1 糞便短鏈脂肪酸含量的檢測

糞便短鏈脂肪酸提?。悍Q取0.1～0.2 g糞便樣品于1 mL含有庚酸(濃度為1 mmol/L)的乙醚溶液中，用均質(zhì)機(jī)勻漿1 min，10 000 r/min離心2 min。轉(zhuǎn)移上清液有內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中進(jìn)行氣相色譜檢測。

氣相色譜檢測：檢測器為FID氫火焰離子檢測器；色譜柱為60～80目(酸洗、硅烷化)不銹鋼柱(25 m×0.320 mm)，涂漬填充10%FFAD和1% H3PO4；升溫程序?yàn)?0 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，以25 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；載氣(N2)壓力260 kPa；氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；檢測溫度280 ℃。N2000色譜工作站收集信號(hào)并檢測。使用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.4.2.2 糞便腸道菌群的檢測

腸道菌群多樣性測序利用Illumina PE300測序平臺(tái)，對(duì)16S rDNA進(jìn)行高通量測序，測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成；基于I-Sanger云平臺(tái)(https:∥www.i-sanger.com/)進(jìn)行生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示。組內(nèi)前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，兩組間樣本的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05視為顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試者基本情況

招募受試者65人，有61人完成試驗(yàn)，受試者年齡、性別、體重等基本情況如表1，兩組間無顯著差異(P>0.05)，可比性較好。

表1 受試者飲用產(chǎn)品前一般情況

2.2 受試者排便情況

常溫酸奶和L9常溫酸奶對(duì)受試者排便情況的影響如表2。表2顯示，飲用前，常溫酸奶組與L9常溫酸奶組的排便次數(shù)、排便狀況積分和糞便性狀積分沒有顯著差異，具有可比性。飲用28 d后，常溫酸奶組的排便次數(shù)顯著高于飲用前(P<0.05)，排便狀況積分和糞便性狀積分與飲用前相比沒有顯著差異；L9常溫酸奶組的排便次數(shù)極顯著高于飲用前(P<0.01)，糞便性狀積分和排便狀況積分極顯著低于飲用前(P<0.01)；兩組間相比，L9常溫酸奶組的排便次數(shù)顯著高于常溫酸奶組(P<0.05)，排便狀況積分和糞便性狀積分極顯著低于常溫酸奶組(P<0.01)。研究結(jié)果表明，常溫酸奶可顯著增加受試者排便次數(shù)，添加滅活副干酪乳桿菌L9后，受試者排便次數(shù)、排便狀況和糞便性狀都有極顯著改善，說明L9有利于提高排便次數(shù)，減少排便不適，形成軟便，改善糞便的質(zhì)量。

2.3 糞便短鏈脂肪酸含量變化

短鏈脂肪酸是腸道微生物發(fā)酵碳水化合物生成的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、丁酸[18],也是表征腸道菌群影響人體健康和生理機(jī)能的重要物質(zhì)。飲用前后受試者糞便中短鏈脂肪酸含量的變化情況如圖1。圖1顯示，飲用前，常溫酸奶組和L9常溫酸奶組的短鏈脂肪酸含量沒有顯著差異，具有可比性。飲用后與飲用前相比，常溫酸奶組丙酸和總酸的含量顯著增加(P<0.05)；L9常溫酸奶組乙酸、丙酸、丁酸和總酸的含量極顯著增加(P<0.01)。兩組間相比，L9常溫酸奶組丁酸含量極顯著高于常溫酸奶組(P<0.01)，丙酸和總酸含量顯著高于常溫酸奶組(P<0.05)。研究結(jié)果表明，常溫酸奶和L9常溫酸奶可以顯著增加糞便中短鏈脂肪酸的含量，添加滅活副干酪乳桿菌L9可以極顯著增加短鏈脂肪酸的含量，說明滅活副干酪乳桿菌L9有利于短鏈脂肪酸的生成。短鏈脂肪酸可刺激腸道神經(jīng)系統(tǒng)，縮短腸道運(yùn)輸時(shí)間，從而緩解便秘[19]。

表2 受試者每周排便情況

*表示組內(nèi)飲用后與飲用前相比具有顯著差異(P<0.05)；**表示組內(nèi)飲用后與飲用前相比具有極顯著差異(P<0.01)；#表示飲用后兩組間具有顯著差異(P<0.05)；##表示飲用后兩組間具有極顯著差異(P<0.01)。

*表示組內(nèi)飲用后與飲用前相比具有顯著差異(P<0.05)；**表示組內(nèi)飲用后與飲用前相比具有極顯著差異(P<0.01)；#表示飲用后兩組間具有顯著差異(P<0.05)；##表示飲用后兩組間具有極顯著差異(P<0.01)。圖1 飲用前后短鏈脂肪酸的變化Fig.1 Changes of short-chain fatty acids before and after intake of yogurt

2.4 腸道菌群的改變

2.4.1群落結(jié)構(gòu)組成 PCA分析

由群落結(jié)構(gòu)組成PCA分析可知(如圖2)，飲用前兩組便秘人群的組間差異ANOSIM分析結(jié)果為R=0.007 4，P=0.298(如圖2(a))，說明兩組人群腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)沒有差異，組間可比性好。常溫酸奶組飲用后(CWd28)與飲用前(CWd0)相比，組間差異ANOSIM分析結(jié)果為R=0.197 8，P=0.001(如圖2(b))，表明飲用常溫酸奶可改變腸道菌群整體結(jié)構(gòu)；L9常溫酸奶組飲用后(L9CWd28)與飲用前(L9CWd0)相比，組間差異ANOSIM分析結(jié)果為R=0.230 8，P=0.001(如圖2(c))，表明飲用L9常溫酸奶改變菌群的整體結(jié)構(gòu)；常溫酸奶與L9常溫酸奶組相比，組間差異ANOSIM分析結(jié)果為R=0.035 3，P=0.075(如圖2(d))，顯示兩組間沒有顯著差異，說明滅活L9對(duì)腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)無顯著影響。以上結(jié)果表明，常溫酸奶和L9常溫酸奶對(duì)腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)有顯著影響，但是滅活L9對(duì)腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)無顯著影響。

每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)人群樣本，PCA分析基于bray_curtis距離算法。圖2 各組小鼠腸道菌群PCA分析Fig.2 PCA of gut microbiota in each group

2.4.2物種組間差異顯著性檢驗(yàn)分析

利用Student’st檢驗(yàn)方法對(duì)物種進(jìn)行兩組間差異顯著性分析，結(jié)果如圖3。圖3顯示，在豐度百分比大于1.0%的物種中，組內(nèi)比較表明，飲用常溫酸奶28 d(CWd28)后，人群糞便中Lachnospiraceae菌顯著降低(P<0.01)，該菌與飲食引起的肥胖具有正相關(guān)性[20];飲用L9常溫酸奶28 d(L9CWd28)后，人群糞便中[Eubacterium]_hallii_group顯著增加(P<0.01)，該菌能夠代謝膳食纖維，產(chǎn)生短鏈脂肪酸[21]。組間比較表明，飲用L9常溫酸奶比飲用常溫酸奶能顯著增加腸道中Blautia(P<0.05)、Ruminococcus_2(P<0.05)和 [Eubacterium]_hallii_group(P<0.01)菌的豐度，Blautia為丁酸產(chǎn)生菌[13],Ruminococcus為短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌[22]。綜上可知，L9常溫酸奶調(diào)節(jié)腸道菌群的能力優(yōu)于普通常溫酸奶，主要體現(xiàn)在其增加產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌屬。

圖3 物種組間差異顯著性分析Fig.3 Significantly altered genera analyzed by Student’s t-test

3 結(jié) 論

本研究通過人群實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了滅活型副干酪乳桿菌L9常溫酸奶通過調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)便秘的緩解作用。測定了短鏈脂肪酸和腸道菌群，探討了滅活副干酪乳桿菌L9緩解便秘的原因。結(jié)果顯示，與飲用普通常溫酸奶相比，飲用滅活型副干酪乳桿菌L9常溫酸奶后，受試者排便次數(shù)顯著增加(P<0.05)，排便狀況和糞便性狀評(píng)分極顯著降低(P<0.01)；糞便中丁酸含量極顯著增加(P<0.01)，丙酸和總酸含量顯著增加(P<0.05)；并顯著增加產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌屬，如Blautia、Ruminococcus_2和[Eubacterium]_hallii_group。研究結(jié)果表明，飲用滅活型副干酪乳桿菌L9常溫酸奶更有利于提高排便次數(shù)，減少排便不適，形成軟便，改善糞便的質(zhì)量，并增加腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌，因此實(shí)現(xiàn)潤腸通便的作用。該研究旨在為滅活型副干酪乳桿菌L9在乳酸菌產(chǎn)品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。