王 晶，史 琪，隨晶晶，常世民,,3，杜 娟，閆訓(xùn)友,,3

1廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院；2河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心；3廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廊坊 065000

多糖(polysaccharide)，又稱為多聚糖，是指由10個(gè)以上的單糖分子縮合的多聚物[1]。在自然界中廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中，并在真菌細(xì)胞壁中約占90%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有多種重要的生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)[2]、抗氧化[3,4]和抗腫瘤[5]等。

鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)歸屬蘑菇目膨瑚菌科狹義小奧德蘑屬[6]，其口味鮮美，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，主要種植于北京、河北、山東、江蘇等華北地區(qū)。目前對該物種的研究主要集中在栽培和活性物質(zhì)提取等方面[3,7]。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，可產(chǎn)生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、NO等炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子(cytokine)或信號(hào)分子，在天然免疫和獲得性免疫中執(zhí)行重要功能[2,7]。本論文通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)研究了初步分離純化的鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和細(xì)胞因子分泌量等免疫功能的影響，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)購自河北廊坊，由河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心完成菌種鑒定[3]。ICR小鼠為斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002)，雄性，5～6周齡，體重25 g左右；F12K培養(yǎng)基為美國Sigma公司產(chǎn)品；特級(jí)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰井a(chǎn)品；DAF-FM雙乙酸鹽(DAF-FM DA)一氧化氮(NO)熒光探針、總一氧化氮檢測試劑盒和雙辛丁酸法(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α、IL-1、IL-6和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)檢測試劑盒為青島海德誠生物工程有限公司產(chǎn)品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MD44透析袋(截留分子量3.5 kD)和24孔板用細(xì)胞爬片為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所需其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水機(jī)為美國Millipore公司產(chǎn)品；ALPHA 1-2 冷凍干燥機(jī)為德國Martin Christ公司產(chǎn)品；CKX41SF倒置顯微鏡(裝有數(shù)碼顯微照相裝置DP71)和BX53熒光顯微鏡(裝有數(shù)碼顯微照相裝置DP73)為日本Olympus公司產(chǎn)品；MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO公司產(chǎn)品；iMark酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 鱗柄小奧德蘑多糖的提取和純化

參考Wang等[3]方法，將鱗柄小奧德蘑子實(shí)體置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎機(jī)粉碎、銅網(wǎng)過濾、95%乙醇除脂、低溫烘干后，采用熱水浸提、離心、除蛋白、透析和真空冷凍干燥等方法，得到鱗柄小奧德蘑多糖(polysaccharide fromO.furfuracea，OFP)樣品。將多糖樣品用0.09 g/L氯化鈉溶液(生理鹽水)配成母液，孔徑為0.22 μm的無菌針頭濾器抽濾后冷藏備用。

多糖含量和蛋白質(zhì)含量測定分別采用苯酚-硫酸法和BCA法(蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒)。

1.3.2 巨噬細(xì)胞的收集

灌洗腹腔法。參考Zhang等[8]方法并稍改進(jìn)，將小鼠處死后，75%醫(yī)用酒精中浸泡2 min，重復(fù)2次轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，取F12K培養(yǎng)液5 mL注入小鼠腹腔，輕柔腹部，吸取腹腔液，離心，將沉淀用F12K培養(yǎng)液(含10% FBS)懸浮后按5×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度，接種至培養(yǎng)板中，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)[9]。

1.3.3 多糖處理

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為空白對照組、多糖處理組和陽性對照組，各組設(shè)5個(gè)重復(fù)，自由攝食和飲水。陽性對照組腹腔注射20 mg/L的LPS溶液1mL，多糖處理組分別腹腔注射50、100和200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖溶液1 mL，空白對照組腹腔注射1 mL無菌生理鹽水，正常飼養(yǎng)24 h后，按“1.3.2”方法收集巨噬細(xì)胞，雞血紅細(xì)胞吞噬法測定巨噬細(xì)胞的吞噬能力，熒光探針法測定細(xì)胞中NO含量。

體外實(shí)驗(yàn)。按“1.3.2”方法收集和接種ICR小鼠巨噬細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，吸棄上層培養(yǎng)基，添加不含血清的F12K培養(yǎng)液，并將細(xì)胞分為陽性對照組、多糖處理組和空白對照組。陽性對照組添加終濃度為20 mg/L的LPS，多糖處理組分別添加終濃度為50、100和200 mg/L的無菌鱗柄小奧德蘑多糖溶液，空白對照組添加等量的無菌生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。雞血紅細(xì)胞吞噬法測定巨噬細(xì)胞的吞噬能力，熒光探針法測定細(xì)胞中NO含量，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的濃度。

1.3.4 細(xì)胞吞噬能力測定

雞血紅細(xì)胞吞噬法。參考Wang等[8,10]方法稍改進(jìn)，收集細(xì)胞至潔凈載玻片上(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))或吸棄細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)液(體外實(shí)驗(yàn))，添加1%(體積比)雞血紅細(xì)胞懸液，經(jīng)37 ℃孵育、磷酸緩沖溶液漂洗、4%多聚甲醛固定、吉姆薩染液(工作液)染色、流水沖洗后鏡檢。巨噬細(xì)胞的吞噬能力用吞噬百分率(%)來評價(jià)，以吞噬雞血紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)量和巨噬細(xì)胞總數(shù)的比值表示[10]。

1.3.5 NO含量的檢測

熒光探針法[7]檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)NO含量。按“1.3.3”方法收集腹腔注射多糖處理24 h的巨噬細(xì)胞，離心后加入適量熒光探針?；虬础?.3.2”方法收集小鼠巨噬細(xì)胞，接種至培養(yǎng)板(內(nèi)置細(xì)胞爬片)中，添加不同濃度多糖處理后，取出細(xì)胞爬片，細(xì)胞面朝上置于濕盒中，加入適量熒光探針[7]。參照DAF-FM DA試劑盒說明，用稀釋400倍的探針，孵育細(xì)胞30 min，洗滌2次后，熒光顯微鏡拍照，軟件IPP(Image-Pro Plus)分析和測定平均光密度值(相對值)[7]。

用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽后，Griess法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中總一氧化氮濃度。按照試劑盒說明，用超純水配制2 mmol/L NADPH，并將試劑盒中NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、2、5、10、20和40 μmol/L。實(shí)驗(yàn)前將Griess reagent I和II，室溫放置30 min，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清60 μL、2 mmol/L NADPH 5 μL、FAD 10 μL和Nitrate reductase 5 μL，混勻，37 ℃孵育30 min；依次加入LDH Buffer 10 μL、LDH 10 μL，混勻，37 ℃孵育30 min；加入Griess reagent I 50 μL和Griess reagent II 50 μL，混勻后室溫孵育10 min。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。酶標(biāo)儀測定A540 nm，根據(jù)NaNO2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組NO濃度。

1.3.6 TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12分泌量的測定

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(雙抗體夾心法)[9]。參照試劑盒說明操作，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度曲線計(jì)算培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鱗柄小奧德蘑多糖含量

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖，采用苯酚-硫酸法測定鱗柄小奧德蘑多糖樣品中糖含量，得到葡萄糖濃度x與吸光度值A(chǔ)的直線回歸曲線為y=0.016 8x+0.031 6；決定系數(shù)[11]r2=0.998 0，表示糖濃度與吸光度值之間具有良好的線性正相關(guān)關(guān)系，經(jīng)計(jì)算，鱗柄小奧德蘑多糖樣品中糖含量為88.75%±1.24%，考慮到多糖提取工藝中的多次透析過程和透析袋的截留的分子量(3.5 kD)大小，認(rèn)為鱗柄小奧德蘑多糖樣品中多糖含量為：88.75%±1.24%。以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用BCA法測定鱗柄小奧德蘑多糖樣品中蛋白質(zhì)含量，得到蛋白質(zhì)濃度x與吸光度值A(chǔ)的直線回歸曲線為y=0.743 9x+0.007 9；決定系數(shù)r2=0.991 8，表示蛋白質(zhì)濃度與吸光度值之間具有良好的相關(guān)關(guān)系，經(jīng)計(jì)算，鱗柄小奧德蘑多糖樣品中蛋白質(zhì)含量為0.96%±0.05%。說明，提取的鱗柄小奧德蘑多糖中的蛋白質(zhì)已被有效去除。

2.2 體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞

采用F12K培養(yǎng)液灌洗腹腔、離心收集和無菌接種等方法，啟動(dòng)小鼠巨噬細(xì)胞的原代培養(yǎng)。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞透光性較好，接種培養(yǎng)板24 h后，絕大多數(shù)細(xì)胞已貼壁或半貼壁，貼壁牢固，呈不規(guī)則形態(tài)(見圖1)，這與Ni[12]和Yu[13]等分離和體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞生長狀態(tài)相似。巨噬細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，體外無法增殖，為防止胎牛血清(FBS)中免疫相關(guān)蛋白或細(xì)胞因子對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，體外接種培養(yǎng)24 h后，將含10% FBS的F12K

圖1 接種培養(yǎng)24 h后的小鼠巨噬細(xì)胞(標(biāo)尺=100 μm)Fig.1 Murine peritoneal macrophages cultured in vitro for 24 h (scale=100 μm)

培養(yǎng)液更換為不含血清的F12K培養(yǎng)液。研究顯示，短期無血清培養(yǎng)不會(huì)影響細(xì)胞的RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成[14]，但時(shí)間過長(超過24 h)會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的大量死亡[15]，故本實(shí)驗(yàn)將鱗柄小奧德蘑多糖處理的時(shí)間控制在24 h。

2.3 多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞由血液循環(huán)中的單核細(xì)胞進(jìn)入組織后分化而來，能夠吞噬和清除凋亡細(xì)胞及非功能性的胞外成分[16]。本實(shí)驗(yàn)采用雞血紅細(xì)胞吞噬法檢測了多糖處理前后小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的變化。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，20 mg/L LPS處理組和200 mg/L鱗柄小奧德多糖處理組巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著增強(qiáng)(見圖2)。

2.4 多糖對小鼠巨噬細(xì)胞合成NO的影響

NO是在外界信號(hào)刺激下，由巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞合成的、可跨質(zhì)膜自由擴(kuò)散的信號(hào)分子[17]。細(xì)胞內(nèi)的NO可使用熒光探針DAF-FMDA檢測，熒光的強(qiáng)弱間接反映細(xì)胞中NO的含量[7,9]；細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量可使用總NO測定試劑盒(硝酸鹽還原酶+Griess法)檢測[7,9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組(生理鹽水組)相比，腹腔注射50～200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h，小鼠巨噬細(xì)胞中熒光探針的平均光密度值均顯著增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中總NO濃度顯著增加(P<0.05)(見表1)，具有濃度依賴性(見圖3和圖5)；體外培養(yǎng)體系中添加終濃度為50～200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h，巨噬細(xì)胞中熒光探針的平均光密度值亦顯著增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中總NO濃度顯著亦增加(P<0.05)(見表1)，具有濃度依賴性(見圖4和圖5)；相同濃度的多糖體內(nèi)外處理24 h對小鼠巨噬細(xì)胞NO的合成無顯著性差異。說明，鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h可促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中NO的合成量。

圖2 鱗柄小奧德多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.2 Effect of OFP on phagocytic activity of murine peritoneal macrophages.注：*與空白對照組相比，P<0.05。Note:*Compared with control group,P<0.05.

2.5 多糖對小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12分泌量的影響

為進(jìn)一步研究鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞免疫功能相關(guān)的細(xì)胞因子分泌量的影響，收集體外實(shí)驗(yàn)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，并參照試劑盒說明進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞可分泌TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12(見表1)，其中TNF-α、IL-1和IL-6的濃度較高，分別為64.40±1.50、62.60±1.75和96.33±2.13 ng/L(見表1)，IL-12濃度較低，只有3.76±0.04 ng/L(見表1)。與空白對照組相比，鱗柄小奧德蘑多糖處理可不同程度的影響小鼠巨噬細(xì)胞對TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的分泌量。其中，終濃度為50～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h可極顯著提高巨噬細(xì)胞對IL-6和IL-12的分泌量(P<0.01)(見表1)，終濃度為100～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖可顯著提高巨噬細(xì)胞對TNF-α、IL-1的分泌量(P<0.05)(見表1)。

圖3 NO熒光探針標(biāo)記的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的小鼠巨噬細(xì)胞(標(biāo)尺=100 μm)Fig.3 Murine peritoneal macrophage treated by OFP in vivo and stained by NO fluorescence probe (scale=100 μm)注：A：空白對照組；B：20 mg/L LPS處理組；C～E：50、100、200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理組；下同。Note:A:Control;B:Treated with 20 mg/L LPS;C～E:Treated with 50,100 and 200 mg/LOFP,respectively；The same below.

圖4 NO熒光探針標(biāo)記的體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞(標(biāo)尺=100 μm)Fig.4 Murine peritoneal macrophages cultured in vitro,treated by OFP and stained by NO fluorescence probe (scale=100 μm).

圖5 各組小鼠巨噬細(xì)胞中NO熒光的平均光密度值Fig.5 The average optic density of NO fluorescence in murine peritoneal macrophages in different groups.注：*與空白對照組相比，P<0.05。Note:*Compared with control group,P<0.05.

3 討論和結(jié)論

目前，對鱗柄小奧德蘑多糖的生物學(xué)活性的研究，集中在抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)方面。如Ma[18]通過灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)一定鱗柄小奧德蘑多糖可提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CD4+T淋巴細(xì)胞含量，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，提高血清中IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α含量。本實(shí)驗(yàn)室前期通過建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，研究了鱗柄小奧德蘑多糖對其中的大鼠肺巨噬細(xì)胞系和結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響。發(fā)現(xiàn)鱗柄小奧德蘑多糖可提高肺巨噬細(xì)胞系對NO和TNF-α的分泌，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[7]。以上研究過程和結(jié)果均未涉及鱗柄小奧德蘑多糖對體外培養(yǎng)的正常的巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

表1 鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12分泌量的影響Table 1 Effects of OFP on the secretion of NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12 of murine macrophages.

注：與空白對照組相比，*P<0.05;**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01.

研究發(fā)現(xiàn)，LPS或其他免疫調(diào)節(jié)劑的刺激，可引起巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞[19,20]，表達(dá)NO[21]、TNF-α、IL-1和IL-6等多種細(xì)胞因子或信號(hào)分子[22]，產(chǎn)生活性氮或活性氧[23,24]，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[7]、抑制病原菌增殖[22]和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。

為了深入了解鱗柄小奧德蘑多糖對機(jī)體正常的巨噬細(xì)胞的影響作用，本論文采用灌洗腹腔的方法，獲得了原代培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞。利用巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系并結(jié)合腹腔注射多糖實(shí)驗(yàn)，采用熒光探針標(biāo)記、總一氧化氮測定和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等方法，較系統(tǒng)的研究了鱗柄小奧德蘑多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力、細(xì)胞中NO合成量、培養(yǎng)上清中NO和細(xì)胞因子分泌量的影響。結(jié)果顯示，一定濃度的鱗柄小奧德蘑多糖處理可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，提高細(xì)胞對NO、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12的合成和分泌。推測，鱗柄小奧德蘑多糖可刺激巨噬細(xì)胞極化為M1型，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力[9]。研究結(jié)果對相關(guān)功能性食品或保健品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。