★ 周茂福 黃麗萍 劉超 侯敏 燕波 官揚 謝永艷 彭楊鵬 陳耀輝

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院 南昌 330004；3.江西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科 南昌 330006）

阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease， AD）是進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)退行疾病，其主要病理變化表現(xiàn)有膽堿神經(jīng)元缺失、細(xì)胞外Aβ 沉積和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化Tau 蛋白形成。AD發(fā)病率逐年增高，但目前尚無特效防治藥物。越來越多的資料證明，AD 的發(fā)生與雌激素水平低下密切相關(guān)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，女性絕經(jīng)后AD 的發(fā)病率是同齡男性的1.5～3 倍［1-2］，并且伴隨著絕經(jīng)后雌激素的減少癡呆的發(fā)生率越高。臨床上雌激素替代療法能顯著改善絕經(jīng)期婦女AD 的相關(guān)癥狀［3］，但會給患者增加患腫瘤的風(fēng)險，從天然藥物中尋找有效的AD 防治藥物是目前研究的熱點。

“腎主智”，腎虛是AD 發(fā)生內(nèi)在機(jī)理，女性絕經(jīng)期前后，天癸將竭，腎精日衰，沖任二脈逐漸虧虛，雌激素分泌不足，腦髓失養(yǎng)，發(fā)為癡呆。二至丸由女貞子、墨旱蓮二味中藥組成，功能補肝腎、益精血之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，二至丸可改善D-半乳糖致衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，具有清除腦自由基、抗衰老和神經(jīng)元保護(hù)等作用［4］。但二至丸能否能改善雌激素缺乏所致AD 動物的認(rèn)知能力？目前未有研究。因此，觀察二至丸對雌激素低下AD 動物學(xué)習(xí)記憶能力的影響，將為臨床應(yīng)用二至丸防治AD 的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 二至丸，江西中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號：20150803，規(guī)格：48g/瓶。用研缽研磨并用雙蒸水配成二至丸高劑量0.2g/mL、低劑量0.1g/mL混懸液。苯甲酸雌二醇購自寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號：S141201，用芝麻油稀釋至0.2mg/mL。

1.2 動 物 昆 明 種 雌 性SPF 級 小 鼠，70 只，22～28g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2013-0004。

1.3 試劑 HE 染色試劑盒、尼氏體染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號分別是20160810、20160726）；免疫組化試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號為：40113）；Aβ1-40 抗體（艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：GR91656-16）。

1.4 儀器 Y 迷宮、八臂迷宮（荷蘭noldus 公司）；分析天平（梅特勒公司）；石蠟切片機(jī)（Lecia 公司）；顯微鏡（Lecia 公司）。

1.5 方法

1.5.1 造模、分組與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，摘除卵巢：先用1%戊巴比妥鈉溶液50mg/kg腹腔注射麻醉，末肋骨下皮常規(guī)皮膚消毒，手術(shù)剪縱向切開皮膚，鈍性分離肌肉，找出卵巢并結(jié)扎卵巢下輸卵管，切除脂肪包裹的兩側(cè)卵巢。假手術(shù)組小鼠僅除去卵巢周圍的部分脂肪。手術(shù)一周后，對去卵巢小鼠進(jìn)行陰道上皮脫落細(xì)胞涂片檢查，取角化細(xì)胞持續(xù)5d 陰性者為實驗用。去卵巢小鼠隨機(jī)分為4 組：即模型組、陽性對照組（雌二醇）、二至丸高劑量組、二至丸低劑量組，每組14 只小鼠，另設(shè)14 只為假手術(shù)組。術(shù)后6 周后開始灌胃給藥，模型組、假手術(shù)組用灌胃雙蒸水，二至丸高低劑量組分別灌胃給予2.0g 生藥/Kg、1.0g 生藥/kg，給藥容量為1.0mL/100g，陽性對照組小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1mL/只，隔天注射1 次，連續(xù)32d。

1.5.2 二至丸對去卵巢AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 在給藥25d 后，用Y 迷宮和八臂迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5.2.1 Y 迷宮實驗 裝置由三個成120°夾角的臂組成，即迷宮的A、B、C 三個臂。每臂長50cm，高15cm，寬6cm。實驗時將小鼠從A 臂末端放入，讓其在三個臂中自由的出入。然后記錄5min 內(nèi)小鼠進(jìn)入三個臂的順序，接著統(tǒng)計小鼠進(jìn)入各個臂的總次數(shù)N 以及計算自發(fā)交替反應(yīng)率C。一次正確的自發(fā)交替反應(yīng)是連續(xù)進(jìn)入三個不同的臂，它反映了小鼠的記憶能力，其計算公式為：C=正確交替反應(yīng)/（N-2） ×l00%。

1.5.2.2 八臂迷宮實驗 實驗前2d 小鼠禁食不禁水，體重下降15%～20%。并進(jìn)行連續(xù)2 天的適應(yīng)性訓(xùn)練，檢測記憶實驗開始時，只在迷宮的1、3、5、7 放射臂頭端放入飼料，將小鼠放入八臂迷宮的中心區(qū)，先用一個不透明的盒子將其罩住，5s 后移去，記錄檢測以下指標(biāo)：①小鼠找到1、3、5、7 臂頭內(nèi)食物所需的總時間。②錯誤總數(shù)，即小鼠出現(xiàn)錯誤的總次數(shù)，每重復(fù)進(jìn)入已吃過餌的臂1 次記為1次錯誤。③首錯前正確數(shù)，即首次錯誤出現(xiàn)前連續(xù)走完正確的臂數(shù)。注意在1、3、5、7 臂外相應(yīng)位置放一些標(biāo)志物，保證在實驗的過程中標(biāo)志物位置和周圍環(huán)境不變，同時整個實驗過程都要在安靜狀態(tài)下進(jìn)行，防止噪音對實驗結(jié)果的影響。

1.5.3 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬神經(jīng)元影響小鼠1%戊巴比妥鈉50mg/kg 腹腔注射麻醉，PBS 心臟灌流沖洗，4%多聚甲醛灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定，取出海馬組織。在4%甲醛溶液中進(jìn)行固定24h，梯度脫水二甲苯透明后用石蠟加以包埋、切片，切片厚度為4μm，按試劑盒說明進(jìn)行HE 染色、尼氏染色，觀察海馬神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)；光鏡下每張切片計數(shù)3 個視野（400×）的細(xì)胞，總和除以3，作為該鼠的海馬細(xì)胞計數(shù)［5］，衡量海馬神經(jīng)元丟失情況。

1.5.4 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ 表達(dá)的影響 取右腦標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片，免疫組化染色觀察海馬CA1 區(qū)Aβ 陽性細(xì)胞的表達(dá)，并按2.4 法進(jìn)行計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 二至丸對去卵巢AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 Y 迷宮實驗結(jié)果 結(jié)果見表1。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠正確交替率明顯較低（P＜0.05），與模型組比較，經(jīng)二至丸給藥干預(yù)后低劑量組小鼠正確交替率明顯提高（P＜0.05），高劑量組和陽性組正確交替率有提高但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 二至丸對AD小鼠Y迷宮正確交替率的影響（，n=14）

表1 二至丸對AD小鼠Y迷宮正確交替率的影響（，n=14）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 劑量 正確交替率/%假手術(shù)組 - 0.67±0.13*模型組 - 0.55±0.09陽性對照組 0.5mg·kg-1 0.66±0.15二至丸高劑量組 2 g·kg-1 0.63±0.12二至丸低劑量組 1 g·kg-1 0.66±0.09*

圖1 海馬形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×400）

2.1.2 八臂迷宮實驗結(jié)果 結(jié)果見表2。與假手術(shù)組相對比，模型組小鼠進(jìn)入1、3、5、7 號臂（有效臂）所需的總時間、總錯誤次數(shù)明顯上升，首錯前正確數(shù)降低；與模型組相對比，二至丸高、低劑量組小鼠進(jìn)入1、3、5、7 號臂所需的總時間與總錯誤次數(shù)明顯下降，首錯前正確升高。陽性對照藥雌二醇組小鼠進(jìn)入有效臂總時間也有縮短少，但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬神經(jīng)元影響 結(jié)果見圖1-2 及表3-4。HE 染色見假手術(shù)組小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞形態(tài)整齊、無破損，核仁清晰，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多；與假手術(shù)組對比，模型組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元丟失對比嚴(yán)重，細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞核染色較深，核固縮較嚴(yán)重，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少；與模型組比照，二至丸高、低劑量組和陽性藥物組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比模型組多，形態(tài)比較完整，排列比較整齊，核仁較少發(fā)生固縮現(xiàn)象。

尼氏染色見假手術(shù)組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞密集，胞漿內(nèi)含有豐富的尼氏小體，甲苯胺藍(lán)染色較深，尼氏體數(shù)量較多；與假手術(shù)相比，模型組小鼠CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列疏松，神經(jīng)元丟失以及核固縮嚴(yán)重，尼氏小體隨神經(jīng)元的丟失而減少；與模型組比較，二至丸高、低劑量組和陽性藥物組神經(jīng)元細(xì)胞較為完整，尼氏小體染色較深且數(shù)量明顯增加，但與假手術(shù)組比較，尼氏小體染色較淺。

圖2 海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)觀察（尼氏染色，×200）

表2 二至丸對AD小鼠八臂迷宮總時間、錯誤總數(shù)、首錯前正確數(shù)（，n=14）

表2 二至丸對AD小鼠八臂迷宮總時間、錯誤總數(shù)、首錯前正確數(shù)（，n=14）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別 劑量 進(jìn)入有效臂所用時間/s 錯誤總數(shù)/次 首錯前正確數(shù)/次假手術(shù)組 - 56.33±35.92* 3.2±0.94* 2.3±0.79*模型組 - 169.40±79.28 4.8±1.33 1.33±0.49陽性對照組 0.5mg·kg-1 105.89±86.09 3.3±1.05* 1.7±0.67二至丸高劑量組 2g·kg-1 49.26±32.91* 3.1±0.74* 2.0±0.66*二至丸低劑量組 1g·kg-1 63.79±46.47* 3.6±1.19* 1.7±0.72

表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響（，n=3，HE染色）

表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響（，n=3，HE染色）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量 細(xì)胞總個數(shù)/個 壞死細(xì)胞個數(shù)/個 細(xì)胞壞死率/%假手術(shù)組 - 52.67±5.03** 3.67±3.05** 7.23±0.06**模型組 - 41.33±4.04 31.33±8.32 75.01±0.13二至丸高劑量組 2g·kg-1 49.67±4.51* 7.33±2.53** 14.74±0.02**二至丸低劑量組 1g·kg-1 47.33±3.05* 8.33±3.78** 17.78±0.09**陽性對照組 0.5mg·kg-1 48.33±3.52* 7.00±2.01** 14.44±0.04**

表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響（，n=3，尼氏染色）

表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響（，n=3，尼氏染色）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量 尼式體個數(shù)/個假手術(shù)組 - 47.33±7.05**模型組 - 8.67±1.53二至丸高劑量組 2g·kg-1 40.67±5.51**二至丸低劑量組 1g·kg-1 39.67±5.03**陽性對照組 0.5mg·kg-1 36.67±8.08**

2.3 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ 表達(dá)的影響 結(jié)果見圖3 和表5。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)見少量Aβ 陽性細(xì)胞，胞漿和突起著色較淺；與假手術(shù)組比較，模型組Aβ 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，胞漿和突起著色較深，部分聚集在一起；與模型組比較二至丸高、低劑量組、陽性藥物組陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，胞漿和突起著色較淺。但在海馬區(qū)各組均未發(fā)現(xiàn)老年斑。

圖3 海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)（免疫組化，×200）

表5 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞Aβ陽性細(xì)胞表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，圍經(jīng)期女性存在較高的癡呆患病率，而且伴隨著絕經(jīng)后雌激素的減少癡呆的發(fā)生率越高［1］。雌激素對于AD 有積極的影響，雌激素能夠促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞軸突、樹突的生長、突觸的形成，雌激素可促進(jìn)長時程增強(qiáng)而促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶， 雌激素具有抗興奮性氨基酸毒性、增加大腦皮質(zhì)血流量和提高大腦葡萄糖的利用率， 雌激素可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡并且可以防止毒性Aβ 片段的產(chǎn)生等［6-7］。去卵巢所致動物模型和雌激素信號通路常用于老年癡呆的發(fā)病機(jī)制及抗老年性癡呆藥物的藥效與機(jī)制研究［8］。

本次試驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組小鼠比較，模型組小鼠在八臂迷宮實驗中其進(jìn)入有效臂所用時間、總錯誤次數(shù)顯著上升，首錯前正確數(shù)明顯降低性延長，且在Y 迷宮實驗中正確交替率明顯減少；形態(tài)學(xué)顯示細(xì)胞總數(shù)顯著減少，壞死細(xì)胞數(shù)顯著增加，細(xì)胞壞死率顯著升高，且尼氏小體隨神經(jīng)元的丟失而減少；CA1 區(qū)Aβ 蛋白表達(dá)增加，表明去卵巢所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠造模成功.與模型組相比，二至丸高、低劑量組小鼠進(jìn)入有效臂所需的總時間明顯下降，且小鼠正確交替率明顯提高（P＜0.05）。在形態(tài)學(xué)觀察中，經(jīng)二至丸給藥干預(yù)后的小鼠，在海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較完整，排列比較整齊，核仁較少發(fā)生固縮現(xiàn)象，神經(jīng)元細(xì)胞較為完整且尼式體數(shù)量較多。Aβ 免疫組化實驗結(jié)果顯示二至丸高、低劑量組Aβ 陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，胞漿和突起著色較淺。以上結(jié)果提示二至丸能夠改善去卵巢AD 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其神經(jīng)元保護(hù)作用和減少Aβ 沉積有關(guān)。其作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。