★ 李佳莉 朱衛(wèi)豐* 唐麗萍 劉星曄 劉水婷

（1.江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004；2.江西省中醫(yī)院藥劑科 南昌 330006）

生肌愈瘍膏是江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院皮膚外科的臨床經驗方，主要用于治療壓瘡、體表潰瘍。由當歸、白芷、紫草、血竭等藥材經麻油熬制后加入白蠟制成。具有解毒斂瘡、養(yǎng)血活血、祛腐生肌［1-2］的功效。為控制其質量，保證患者用藥安全，參照國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第20 號-《醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法》以及《江西省醫(yī)療機構制劑注冊管理實施細則》建立生肌愈瘍膏的質量標準。制定了當歸、紫草、血竭的薄層色譜（TLC）鑒別與血竭素的含量測定方法，并按照中藥質量標準分析方法驗證指導原則對所制定的方法進行驗證［3-5］。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；AP5001N 電子

天平（上海菁海儀器有限公司）；SZ-97A 型自動三重水蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；CW-80A 型漩渦混勻器（上海青浦滬西儀器廠）；EAELA 旋轉蒸發(fā)儀（N-1001 上海愛朗儀器有限公司）；KQ-250VDB 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；薄層層析硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠）；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614）、藁本內酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111737-201507）、血竭高氯酸鹽對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110811-201707）；當歸對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120927-201315）、紫草（新疆紫草）對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121430-201504）、血竭對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120906-201611）；生肌愈瘍膏樣品（批號：20190413、20190414、20190415）及相應陰性樣品均由現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室提供；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜條件的考察 采用單因素試驗確定最佳點樣量、溫濕度，以獲得較理想的薄層鑒別條件。

2.1.1 當歸

2.1.1.1 阿魏酸

2.1.1.1.1 點樣量的考察 取當歸對照藥材0.6g 加80℃熱水80mL，密塞，振搖5min 后，80℃水浴30min，再振搖5min，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。分別吸取1μL、4μL、6μL、8μL 點于同一塊硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（365nm）下檢視，以4μL 點樣量的斑點清晰、圓整且不拖尾，故定點樣量為4μL，見圖1。

圖1 阿魏酸對照藥材的TLC圖譜

2.1.1.1.2 不同展開溫濕度的考察 取當歸對照藥材溶液、阿魏酸對照品溶液、當歸供試品、當歸陰性對照品溶液各4μL 根據(jù)“2.2.1.1”項下條件及方法分別點于硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開系統(tǒng)，分別在RT：14 ℃、RH：88%和RT：31 ℃、RH：61%兩種溫濕度條件下展開。結果表明，展開溫濕度對展開效果影響不大，各斑點均能有效分開，見圖2。

圖2 阿魏酸的TLC圖譜

2.1.1.2 藁本內酯

2.1.1.2.1 點樣量的考察 取當歸對照藥材0.5g 加甲醇60mL，密塞，超聲15min，冰浴1h 后，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。分別吸取1μL、3μL、6μL、10μL 點于同一塊硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（365nm）下檢視，以3μL 點樣量的斑點清晰、圓整且不拖尾，故定點樣量為3μL，見圖3。

圖3 藁本內酯對照藥材的TLC圖譜

2.1.1.2.2 不同展開溫濕度的考察 取當歸對照藥材溶液、藁本內酯對照品溶液、當歸供試品、當歸陰性對照品溶液各3μL 根據(jù)“2.2.1.2”項下條件及方法分別點于硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開系統(tǒng)，分別在RT：20℃、RH：82%和RT：32℃、RH：56%兩種溫濕度條件下展開。結果表明，展開溫濕度對展開效果影響不大，各斑點均能有效分開，見圖4。

圖4 藁本內酯的TLC圖譜

2.1.2 紫草

2.1.2.1 點樣量的考察 取紫草對照藥材0.25g，用1%的NaOH 溶液振搖提取2 次，每次30mL，合并提取液，滴加鹽酸，使液面浮有紅色油狀物，加乙醚80mL，振搖提取，分取乙醚液，揮干，殘渣加無水乙醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。分別 吸 取1μL、3μL、6μL、10μL 點 于 同 一 塊 硅膠G 薄層板上，以石油醚- 乙酸乙酯- 冰醋酸（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%氫氧化鈉甲醇溶液，日光下檢視，以1μL點樣量的斑點清晰、圓整且不拖尾，故定點樣量為1μL，見圖5。

圖5 紫草對照藥材的TLC圖譜

2.1.2.2 不同展開溫濕度的考察 取紫草對照藥材溶液、左旋紫草對照品溶液、紫草供試品、紫草陰性對照品溶液各1μL 根據(jù)“2.2.2”項下條件及方法分別點于硅膠G 薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（17∶2∶1）為展開系統(tǒng)，分別在RT：22℃、RH：80%和RT：32℃、RH：56%兩種溫濕度條件下展開。結果表明，展開溫濕度對展開效果影響不大，各斑點均能有效分開，見圖6。

圖6 紫草的TLC圖譜

2.1.3 血竭

2.1.3.1 點樣量的考察 取血竭對照藥材0.2g，加甲醇10mL，密塞，超聲15min，冰浴1h 后，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。分別吸取1μL、3μL、6μL、10μL 點于同一塊硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視，以1μL 點樣量的斑點清晰、圓整且不拖尾，故定點樣量為1μL，見圖7。

圖7 血竭對照藥材的TLC圖譜

2.1.3.2 不同展開溫濕度的考察 取血竭對照藥材溶液、血竭高氯酸鹽對照品溶液、血竭供試品、血竭陰性對照品溶液各1μL 根據(jù)“2.2.3”項下條件及方法分別點于硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開系統(tǒng)，分別在RT：20℃、RH：82%和RT：31℃、RH：60%兩種溫濕度條件下展開。結果表明，展開溫濕度對展開效果影響不大，各斑點均能有效分開，見圖8。

圖8 血竭的TLC圖譜

2.2 薄層鑒別

2.2.1 當歸

2.2.1.1 阿魏酸 取生肌愈瘍膏20g，加80℃熱水80mL，密塞，振搖5min 后，80℃水浴30min，再振搖5min，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液；另取當歸對照藥材0.6g 加80℃熱水80mL，密塞，振搖5min 后，80℃水浴30min，再振搖 5min，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為對照藥材溶液；另取阿魏酸對照品，加甲醇制成1mg/mL 的對照品溶液；再取不含當歸的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照TLC 法［6］試驗，吸取上述4 種溶液各4μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（365nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同的熒光斑點；陰性對照無干擾。阿魏酸的TLC 圖譜見圖9。

圖9 阿魏酸的TLC圖譜

2.2.1.2 藁本內酯 取生肌愈瘍膏10g，加甲醇 60mL，密塞，超聲15min，冰浴1h 后，過濾，蒸干，殘渣加甲醇 1mL 使溶解，作為供試品溶液；另取當歸對照藥材0.5g 加甲醇 60mL，密塞，超聲15min，冰浴1h 后，過濾，蒸干，殘渣加甲醇 1mL 使溶解，作為對照藥材溶液；另取藁本內酯對照品，加甲醇制成1mg/mL 的對照品溶液；再取不含當歸的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照TLC 法［6］試驗，吸取上述4 種溶液各3μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（365nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同的熒光斑點；陰性對照無干擾。藁本內酯的TLC 圖譜見圖10。

圖10 藁本內酯的TLC圖譜

2.2.2 紫草 取生肌愈瘍膏10g，加石油醚（60～90℃）80mL 使溶解，用1%的NaOH 溶液振搖提取2 次，每次30mL，合并提取液，滴加鹽酸，使液面浮有紅色油狀物，加乙醚80mL，振搖提取，分取乙醚液，揮干，殘渣加無水乙醇1mL 使溶解，作為供試品溶液；另取紫草對照藥材0.25g，用1%的NaOH 溶液振搖提取2 次，每次30mL，合并提取液，滴加鹽酸，使液面浮有紅色油狀物，加乙醚80mL，振搖提取，分取乙醚液，揮干，殘渣加無水乙醇1mL 使溶解，作為對照藥材溶液；另取左旋紫草素對照品，加無水乙醇制成0.2mg/mL 的對照品溶液；再取不含紫草的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照TLC 法［6］試驗，吸取上述4 種溶液各1μL，分別點于同一塊硅膠G 薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%氫氧化鈉甲醇溶液，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同的紅色斑點，噴顯色劑后斑點呈藍色，陰性對照無干擾。紫草的TLC 圖譜見圖11。

圖11 紫草的TLC圖譜

2.2.3 血竭 取生肌愈瘍膏10g，加甲醇60mL，密塞，超聲15min，冰浴1h 后，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液；另取血竭對照藥材0.2g，加甲醇10mL，密塞，超聲15min，冰浴1h后，過濾，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為對照藥材溶液；另取血竭高氯酸鹽對照品，加3%磷酸甲醇制成0.2mg/mL 的對照品溶液；再取不含血竭的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照TLC法［6］試驗，吸取上述4 種溶液各1μL，分別點于同一塊硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同橙色斑點；陰性對照無干擾。血竭的TLC 見圖12。

圖12 血竭的TLC

2.3 含量測定

2.3.1 血竭素

2.3.1.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini 5u C18110A（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05moL/L磷酸二氫鈉（35∶65）；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：440nm；進樣量：10μL。

2.3.1.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品，置10mL 容量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并定容，搖勻，作為血竭素高氯酸鹽對照品母液儲備液。取血竭素高氯酸鹽儲備液5mL 至10mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，制成血竭素濃度為36.31μg/mL 的對照品溶液（按血竭素計算，血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重量/1.377）。（2）供試品溶液：取樣品5.0g，精密稱定，加入硅藻土10.0g，研勻，置具塞錐形瓶中，精密量取3%磷酸甲醇50mL 加入，稱定重量，超聲15min，避光，靜置5h后，稱定重量，用3%磷酸甲醇補足減失重量，搖勻，取上清液濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.1.3 專屬性試驗 取處方中除血竭外的其他成分，按照生肌愈瘍膏的制法制成不含血竭的陰性樣品，按照“2.3.1.2”項下供試品制備方法處理得陰性對照品溶液，色譜圖見圖13。

圖13 血竭素高效液相色譜圖

2.3.1.4 線性關系考察 精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品母液儲備液，加甲醇稀釋濃度為145.24μg/mL、72.62μg/mL、36.31μg/mL、18.16μg/mL、9.08μg/mL、4.54μg/mL 的對照品溶液，注入液相色譜儀。按“2.3.1.1”項下色譜條件測定峰面積。以對照品濃度（C）為橫坐標，峰面積分值（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A=10.547C - 1.97227，r=0.999 9（n=6），結果表明，血竭素檢測濃度在4.54μg/mL～145.24μg/mL 范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.3.1.5 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液（72.62μg/mL）的對照品溶液10μL，重復進樣測定6 次，測定峰面積。結果表明，血竭素RSD=0.17%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號20190413），分 別 于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h 進樣，測定。結果，RSD=2.76%（n=8），表明供試品在24h 內穩(wěn)定。

2.3.1.7 重現(xiàn)性試驗 取生肌愈瘍膏（批號20190413）6 份，每份5g，按“2.2.3.1” 項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定。結果，血竭素的平均含量為0.28mg/g，RSD=3.83%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.1.8 回收率試驗 稱取已知含量的生肌愈瘍膏2g（批號20190413），共6 份，精密稱定，分別加入36.31μg/mL 濃度的對照品溶液，其余按“2.3.1.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，計算回收率，見表1。

表1 加樣回發(fā)試驗結果（n=6）

2.3.2 含量測定 取3 批生肌愈瘍膏（20190413、20190414、20190415），按“2.3.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.3.1.1”項色譜條件進行測定。結果3 批樣品中血竭素的含量分別為0.277，0.281，0.282mg/g。

3 討論

3.1 當歸質量控制指標的選擇 當歸作為該制劑中處方量最大的藥物，具有阿魏酸和藁本內酯兩大藥效成分，這兩成分極性完全相反，在同一薄層板中顯色，對提取方式和展開劑的要求較為苛刻，本研究對兩成分分開鑒別的方式進行了探索；考察了甲醇、乙醇和水分別作為提取溶劑的薄層斑點效果，結果發(fā)現(xiàn)阿魏酸采用熱水水浴提取、藁本內酯采用甲醇超聲提取，效果較好；參考藥典中對當歸的定性鑒別給出的正己烷-乙酸乙酯（4∶1），環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）兩個展開系統(tǒng)，經試驗環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）對阿魏酸展開效果較好，而藁本內酯采用正己烷-乙酸乙酯（4∶1）層析，斑點清晰不受油性成分影響，展距合適。

3.2 紫草質量控制指標的選擇［7-8］在進行紫草薄層鑒別時，分別比較了藥典給出的環(huán)己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）和文獻中的石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（17∶2∶1）兩個展開系統(tǒng)的薄層效果，結果顯示，紫草素使用前者作為其展開劑時，紫草素上方斑點縱向擴散較嚴重，采用后者作為展開劑，可大大減輕其擴散程度。

3.3 當歸和血竭質量控制指標的選擇 當歸和血竭藥材的鑒別中，供試品的制備方式采用了冰浴，該步驟可以促使部分油性基質白蠟析出，通過過濾將其與供試液分開，可減少跑板時油性物質對斑點形狀的影響；在確定血竭的薄層鑒別方法過程中，曾采用乙醇作為提取溶劑，薄層結果中得到的樣品斑點受油脂成分的影響中部凹陷。而甲醇作為提取溶劑，薄層斑點清晰，不受其他成分的影響。

3.4 制備供試品時分散劑的選擇 根據(jù)相關文獻報道［9-10］，硅藻土作為油脂性基質軟膏的分散劑，具有吸附與利于解吸附的作用，不至于明顯改變制劑的酸堿性，避免酸堿性的改變對某些成分溶解能力的影響。因此，本實驗采用硅藻土作為生肌愈瘍膏的分散劑，提高溶劑的接觸面積，有利于提取。