涂亞輝，鄧曉軍，鐘佳琪，趙超敏，羅 勇，潘 潔，徐仲杰

(1.上?；ぱ芯吭河邢薰荆虾?200062；2.國家同位素工程技術(shù)研究中心 上海分中心，上海 200062；3.上海出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135)

甲基毒死蜱又名雷丹，是一種有機(jī)磷殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較為廣泛，但同時會導(dǎo)致大氣、土壤、水等自然環(huán)境受到污染，并通過一定的富集作用，殘留至蔬菜水果等食品，引起人體產(chǎn)生一系列的中毒反應(yīng)，導(dǎo)致有機(jī)磷農(nóng)藥殘留食品安全問題頻出。因此，世界上許多國家已經(jīng)針對不同食品類別制定了甲基毒死蜱的最大殘留檢測限量，使得這類化合物的殘留含量檢測引起廣泛關(guān)注[1-3]。

國內(nèi)外針對有機(jī)磷農(nóng)藥甲基毒死蜱殘留檢測分析方法主要有光電化學(xué)法、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、基質(zhì)固相分散法等[4-8]，但是，這些分析方法存在一定的問題，如樣品的預(yù)處理復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)影響較大等，嚴(yán)重影響了分析檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，現(xiàn)代食品安全檢測需要開發(fā)更準(zhǔn)確有效的檢測方法。為了解決這些問題，采用同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)可準(zhǔn)確有效地檢測食用品中有機(jī)磷農(nóng)藥甲基毒死蜱殘留含量[9-11]。本文旨在合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甲基毒死蜱-D6作為檢測用內(nèi)標(biāo)試劑，廣泛地應(yīng)用于高效精確的農(nóng)藥殘留食品安全檢測，讓放心食品進(jìn)入生活，具有一定實用意義。

對于甲基毒死蜱的合成，有相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]報道以O(shè),O-二甲基硫代磷酰氯為原料，與相應(yīng)的3,5,6-三氯吡啶-2-醇或其鈉鹽在水相體系或者兩相復(fù)合體系中，在相轉(zhuǎn)移催化劑的作用下發(fā)生取代反應(yīng)，合成相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于穩(wěn)定同位素D標(biāo)記的甲基毒死蜱的合成及其作為穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑檢測甲基毒死蜱含量的相關(guān)報道。本研究結(jié)合O,O-二甲基硫代磷酰氯及甲基毒死蜱的工藝合成路線，以三氯硫磷和甲醇-D4為起始原料進(jìn)行親核取代反應(yīng)，得到中間體O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6，然后與3,5,6-三氯吡啶-2-醇作用得到目標(biāo)產(chǎn)物甲基毒死蜱-D6，可作為穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

C-MAGHS7型加熱磁力攪拌器：德國IKA公司；RE-52A型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、DLSB-10/40型低溫冷卻循環(huán)泵：上海衛(wèi)凱儀器有限公司；600 MHz核磁共振譜儀：美國Bruker公司；GC 7890A氣相色譜儀：美國Agilent公司；Trace 1310-ISQLT頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Fisher。

三氯硫磷：純度98%，上?；ぱ芯吭河邢薰?；乙醇、甲醇、丙酮、甲苯、二氯甲烷、乙醚、乙腈、苯、正己烷、乙酸乙酯：分析純(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉：AR，江蘇強(qiáng)盛化學(xué)試劑有限公司；1-甲基咪唑：純度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硼酸、三乙基芐基氯化銨：98%，安耐吉化學(xué)；甲醇-D4：豐度99atom%D，百靈威科技有限公司；3,5,6-三氯吡啶-2-醇：98%，上海特伯化學(xué)科技有限公司。

1.2 實驗方法

甲基毒死蜱-D6的總體合成路線示于圖1。

圖1 甲基毒死蜱-D6的總體合成路線

1.2.1O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6(A3-D6)的合成 合成路線示于圖2。稱取6.67 g(39.0 mmol)三氯硫磷A1于25 mL的單口圓底燒瓶中，冰鹽浴冷卻至-5 ℃，在攪拌的條件下向反應(yīng)體系中緩慢滴加5.61 g甲醇-D4(156.0 mmol)，保持溫度為-4～-6 ℃，攪拌15 min，然后向反應(yīng)體系中加入8 mL冰水以淬滅反應(yīng)，保持溫度10 ℃以下，攪拌15 min，靜置分液，取有機(jī)相，得到無色液體4.9 g，即產(chǎn)物甲基二氯化物A2-D3，根據(jù)氣相檢測面積歸一法計算收率為27.0%(以甲醇-D4計)，純度99.1%。直接投入下一步反應(yīng)。

圖2 O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6(A3-D6)的合成路線

稱取4.90 g(28.9 mmol)的A2-D3，8 mL的丙酮于50 mL的三口燒瓶中，冰鹽浴冷卻至-5 ℃，在攪拌的條件下向反應(yīng)體系中緩慢地滴加4.70 g甲醇-D4(115.6 mmol)，保持溫度為-4～-6 ℃，攪拌15 min，取10 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氫氧化鈉水溶液緩慢滴加至反應(yīng)體系中，同時檢測反應(yīng)體系中的pH，直至pH=10，停止滴加，取8 mL冰水加入到反應(yīng)體系淬滅反應(yīng)，攪拌15 min后，靜置分液，取有機(jī)相，旋蒸除去丙酮試劑，得到無色液體3.1 g，即產(chǎn)物A3-D6，根據(jù)氣相檢測面積歸一法計算收率為23.6%(以甲醇-D4計)。

1.2.2甲基毒死蜱-D6的合成 合成路線示于圖3。稱取1.98 g(10.0 mmol)的3,5,6-三氯-2-吡啶醇，0.48 g(12.0 mmol)的氫氧化鈉于配有回流冷凝管和恒壓滴液漏斗的100 mL三口圓底燒瓶中，加入30 mL的水，加熱攪拌使得固體物質(zhì)完全溶解，降至室溫后向反應(yīng)體系中投入0.58 g(10.0 mmol)氯化鈉、0.12 g(2.0 mmol)硼酸、0.02 g(0.1 mmol)三乙基芐基氯化銨、8.2 mg(0.1 mmol)1-甲基咪唑和20 mL的二氯甲烷，通過滴液漏斗將1.83 g(11.0 mmol)O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6滴加至反應(yīng)體系中，加熱至42 ℃，繼續(xù)反應(yīng)1.5 h，停止反應(yīng)，冷卻至室溫，靜置分液，利用二氯甲烷進(jìn)行萃取(3×20 mL)，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸除去二氯甲烷，得到棕色固體。利用正己烷：乙酸乙酯=20∶1進(jìn)行柱層析提純，得到白色固體，再用無水乙醇重結(jié)晶，得到2.5 g白色晶體，氣相純度為98.3%，同位素豐度為99.0atom%D，收率為69.3%(以A3-D6計)。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ ppm 7.86(s, 1H)。

2 結(jié)果與討論

穩(wěn)定同位素標(biāo)記中間體O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6的純度及收率是甲基毒死蜱-D6合成的關(guān)鍵因素，因此O,O-二甲基硫代磷酰氯的合成利用天然豐度原料進(jìn)行條件優(yōu)化[15-16]。

2.1 O,O-二甲基硫代磷酰氯合成的影響因素

2.1.1三氯硫磷和甲醇的摩爾數(shù)之比對甲基二氯化物合成的影響 三氯硫磷與甲醇的投料摩爾數(shù)之比對甲基二氯化物的合成有著重要的影響，見表1。

表1 三氯硫磷與甲醇的物質(zhì)的量比對反應(yīng)的影響

注: 1)n1∶n2=n(三氯硫磷)∶n(甲醇)；2)收率為氣相檢測收率，以甲醇計。

由表1結(jié)果可知，甲醇與三氯硫磷在低溫條件下容易發(fā)生取代反應(yīng)生成甲基二氯化物即A2，目標(biāo)產(chǎn)物的含量隨著甲醇量的增加也逐漸提高，但甲醇過多，反而導(dǎo)致副產(chǎn)物A3含量增加，導(dǎo)致下一步甲基一氯化物A3(O,O-二甲基硫代磷酰氯)合成反應(yīng)的收率降低。因此，選擇三氯硫磷與甲醇的物質(zhì)的量之比為1∶4作為最佳優(yōu)化條件。

2.1.2甲基二氯化物和甲醇的物質(zhì)的量之比對甲基一氯化物合成的影響 甲基二氯化物(A2)和甲醇的物質(zhì)的量之比對甲基一氯化物(A3)合成的影響結(jié)果列于表2。

以甲基二氯化物(A2)為原料進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)活性降低，進(jìn)一步取代反應(yīng)生成甲基一氯化物較為困難，需加入NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的酸堿性，促使取代反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。隨著甲醇含量的增加，原料反應(yīng)完全，目標(biāo)產(chǎn)物A3含量也逐漸提高，但是相應(yīng)副產(chǎn)物的含量逐漸增多，影響目標(biāo)產(chǎn)物的收率。因此，選擇A2與甲醇的物質(zhì)的量之比為1∶4作為最佳優(yōu)化條件。

表2 甲基二氯化物(A2)和甲醇的物質(zhì)的量比對反應(yīng)的影響

注：1)n1∶n2=n(A2)∶n(甲醇)；2)收率為氣相檢測收率，以甲醇計。

2.1.3反應(yīng)溶劑對甲基一氯化物(A3)合成的影響 甲基一氯化物的合成是雙分子的親核取代反應(yīng)，甲氧基負(fù)離子在溶劑中易形成氫鍵被溶劑化，降低其反應(yīng)活性。向反應(yīng)體系中增加非質(zhì)子性溶劑可以避免被溶劑化，不僅可以降低甲醇用量，減少副產(chǎn)物三甲酯的產(chǎn)生，而且減少水解副反應(yīng)的發(fā)生[17]。

篩選不同的非質(zhì)子性溶劑，進(jìn)行條件優(yōu)化篩選，對甲基一氯化物合成的影響列于表3。

表3 非質(zhì)子性溶劑對A3合成的影響

注：收率為氣相檢測收率，以甲醇計。

由表3數(shù)據(jù)可以看出，在反應(yīng)體系中加入非質(zhì)子溶劑丙酮可以有效地提高甲基一氯化物(A3)的含量，利于甲基毒死蜱的合成。

2.1.4O,O-二甲基硫代磷酰氯A3合成穩(wěn)定性實驗 通過對O,O-二甲基硫代磷酰氯合成反應(yīng)條件的優(yōu)化篩選，第一步反應(yīng)選擇三氯硫磷與甲醇的物質(zhì)的量之比為1∶4，第二步反應(yīng)選擇A2與甲醇的物質(zhì)的量之比為1∶4及加入非質(zhì)子溶劑丙酮作為反應(yīng)最佳優(yōu)化條件，利用天然豐度甲醇進(jìn)行穩(wěn)定性重復(fù)實驗，具有較好的重復(fù)性，結(jié)果列于表4。

表4 穩(wěn)定性重復(fù)實驗數(shù)據(jù)

注：收率為氣相檢測收率，以甲醇計。

2.2 甲基毒死蜱的合成

根據(jù)甲基毒死蜱的合成工藝[13]，按照n(A3)∶n(3,5,6-三氯-2-吡啶醇)∶n(氫氧化鈉)∶n(氯化鈉)∶n(硼酸)∶n(三乙基芐基氯化銨)∶n(1-甲基咪唑)=1.00∶1.10∶1.20∶1.00∶0.20∶0.01∶0.01的物質(zhì)的量比，二氯甲烷和水作為溶劑，回流1.5 h，利用二氯甲烷進(jìn)行萃取，進(jìn)行柱層析得到目標(biāo)產(chǎn)物，收率為70.1%(以A3計)，純度為98.3%。

2.3 豐度實驗

經(jīng)過多次實驗條件優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)合成路線，經(jīng)重復(fù)實驗驗證后，以甲醇-D4為同位素起始原料進(jìn)行豐度實驗合成甲基毒死蜱-D6，以消耗的甲醇-D4計，甲基毒死蜱-D6的總收率為44.2%，純度為98.3%，同位素豐度為99.0atom%D。

2.4 產(chǎn)品結(jié)構(gòu)表征

甲基毒死蜱-D6的1H NMR譜圖如圖4所示。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ ppm 7.86(s, 1H)。譜圖積分為1個氫，與天然豐度的甲基毒死蜱進(jìn)行對比，甲氧基上的氫被氘原子取代，與甲基毒死蜱-D6結(jié)構(gòu)一致。

圖4 甲基毒死蜱-D6的1H NMR譜圖

通過對比產(chǎn)品與天然豐度甲基毒死蜱的MS數(shù)據(jù)，甲基毒死蜱-D6產(chǎn)品的GC-MS圖譜(圖5)中主峰m/z=131.0，為甲基毒死蜱-D6減去3,5,6-三氯-2-吡啶醇，即[M-198.4+1]+峰，其質(zhì)量數(shù)131.0≈328.47-198.4+1。其中，328.47為甲基毒死蜱-D6的相對分子質(zhì)量，198.4為3,5,6-三氯-2-吡啶醇的相對分子質(zhì)量，0.07的質(zhì)量數(shù)在儀器誤差之間?？梢源_定合成的產(chǎn)物為甲基毒死蜱-D6。以甲基毒死蜱-D6的[M-198.43+1]+峰強(qiáng)度計算，豐度為99.0atom%D。

圖5 甲基毒死蜱-D6的GC-MS譜圖

3 結(jié)論

本文以甲醇-D4為穩(wěn)定同位素標(biāo)記原料，得到穩(wěn)定同位素標(biāo)記中間體O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6。經(jīng)兩相復(fù)合體系發(fā)生取代反應(yīng)得到甲基毒死蜱-D6，利用簡單易得的甲醇-D4作為原料，以三步的取代反應(yīng)，合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甲基毒死蜱-D6氘代試劑，目前無相關(guān)的文獻(xiàn)報道。以消耗的甲醇-D4計，甲基毒死蜱-D6收率為44.2%，純度為98.3%，同位素豐度為99.0atom%D，該合成工藝簡單易操作，適用于實驗室合成，氘代產(chǎn)品可作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)試劑應(yīng)用于食品安全農(nóng)藥殘留檢測。