E2F-1過表達對結(jié)直腸癌細胞預(yù)后的影響

徐君毅，以 敏，宋學(xué)民

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545005）

E2F-1參與構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，調(diào)控多種靶基因參與轉(zhuǎn)錄進程，在細胞周期進展中具有重要作用。E2F-1與胃癌、結(jié)腸癌等多種消化道腫瘤的發(fā)生也存在密切相關(guān)性[1-2]，穩(wěn)定的E2F-1過表達可抑制MGC-803胃癌細胞的增殖過程[3]。為研究E2F-1與結(jié)直腸癌的關(guān)系，我們檢測了結(jié)腸癌標本中E2F-1的表達情況，并構(gòu)建E2F-1真核載體，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細胞株，初步探討E2F-1過表達對結(jié)腸癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收取廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院胃腸外科原發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本，同時收取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上正常組織，分別作為腫瘤組和對照組，每組各35例。腫瘤組標本均需經(jīng)病理明確診斷，對照組標本病理證實無腫瘤細胞浸潤。所有采集標本離體30分鐘內(nèi)投入液氮中速凍10 min，然后送入-70℃冰箱保存。

1.2 主要材料

結(jié)腸癌LoVo細胞株（中科院上海細胞所），鼠抗人E2F-1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），免疫組化試劑和Western blot實驗試劑（武漢博士德公司），pCMV-HA真核載體（美國Clontech公司），引物由上海生工合成。

1.3 Western blot

取出腫瘤組和對照組組織標本，病理冰凍切片機上切成40～50 μm薄片，組織裂解法抽提組織標本核蛋白，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，封閉液密封2 h，加入鼠抗人E2F-1一抗（1:200）4℃孵育過夜，TBST漂洗60 min。加入HRP標記的山羊抗鼠二抗（1:1000），25℃孵育1 h，TBST漂洗60 min。使用DAB顯色試劑盒進行顯色后，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析。內(nèi)參蛋白為β-actin，以E2F-1與β-actin比值代表E2F-1表達水平。

1.4 E2F-1真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染

1.4.1 引物設(shè)計與合成。依據(jù)GeneBank中E2F-1 DNA序列（登錄號：NM_005225.1），Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物。第二對引物兩端包含EcoRⅠ酶切位點。

上游引物 下游引物 產(chǎn)物長度第一對 5’GGACTTTGCAGGCAGCGGCG3’ 5’CTGGAAACCCTGGTCCCT CCAAGC3’ 1462bp第二對 5’GAATTCATGGCCTTGGCCGGGGC3’ 5’GAATTCTCAGAAATCCAGGGGGGTG 3’ 1326bp

1.4.2 采用二次PCR的方法擴增E2F-1完整序列。第一次PCR以人肝臟細胞E2F-1 mRNA作為模板，擴增產(chǎn)物長度1462 bp。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，產(chǎn)物長度為1326 bp。二次PCR后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.3 真核表達載體的構(gòu)建。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收并純化后，EcoRⅠ內(nèi)切酶進行酶切，獲得E2F-1全序列片段，然后連接至pCMV-HA質(zhì)粒，篩選陽性表達質(zhì)粒酶切后電泳鑒定，并送上海生工測序驗證。

1.4.4 結(jié)腸癌LoVo細胞株的培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。細胞培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2的溫箱，含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將構(gòu)建成功的真核表達質(zhì)粒和脂質(zhì)體均勻混合，室溫靜置20 min后加入細胞培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)染。24 h、48 h后收集細胞，提取總蛋白，Western Blot分析驗證，確認能穩(wěn)定表達E2F-1蛋白。

1.4.5 細胞克隆形成實驗：取E2F-1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LoVo細胞和空轉(zhuǎn)的LoVo細胞，制成細胞懸液后按梯度倍數(shù)稀釋，接種于6孔板，培養(yǎng)14天。固定細胞后，適量GIMSA染色液染色，顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率。

1.4.6 細胞生長曲線（MTS法）：取穩(wěn)定表達E2F-1基因的LoVo細胞和空載體轉(zhuǎn)染的LoVo細胞，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，接種到96孔板，每孔體積100ul，持續(xù)培養(yǎng)7天。呈色時每孔加MTS溶液20 ul，繼續(xù)孵育2 h，測定490 nm波長吸收值。所記錄結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，Western blot結(jié)果行成對樣本t檢驗，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義；細胞克隆形成實驗和細胞生長曲線結(jié)果采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot結(jié)果

采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析。以E2F-1與β-actin條帶比值代表E2F-1表達水平。腫瘤組與對照組平均表達水平分別為1.043±0.212和0.590±0.177，屬于服從正態(tài)分布的連續(xù)型實驗數(shù)據(jù)，采用配對t檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 E2F-1穩(wěn)定過表達對結(jié)腸癌LoVo細胞株的影響

2.2.1 細胞克隆形成實驗：轉(zhuǎn)染并過表達E2F-1蛋白的結(jié)腸癌LoVo細胞形成的克隆數(shù)量明顯少于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的LoVo細胞，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。（見圖1）。

2.2.2 細胞生長曲線（MTS法）：活細胞的數(shù)量與490nm吸光度成正比，統(tǒng)計結(jié)果顯示過表達E2F-1的LoVo細胞繁殖速度受到抑制，明顯慢于對照組LoVo細胞，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。（見圖2）。

圖1 克隆形成實驗結(jié)果

圖2 MTS法繪制的細胞生長曲線

3 討 論

E2F-1是調(diào)節(jié)細胞周期進展的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，通過調(diào)控下游多種靶基因的表達發(fā)揮作用，而其自身的活性變化則受到pRb的直接調(diào)節(jié)[4]。G1早期，精氨酸甲基化在細胞周期控制過程中負性地調(diào)節(jié)pRb的抑癌功能，部分是通過為Cdk復(fù)合磷酸化創(chuàng)造更好的底物和干擾pRb與E2F-1的相互作用，從而抑制細胞進入S期所需基因的轉(zhuǎn)錄。

E2F-1表達失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性[5]，包括肺癌[6]、肝癌[7]、乳腺癌[8]、膀胱癌[9]和胰腺癌[10]。E2F-1在胃癌中也同樣具有表達異常的現(xiàn)象，并且慢病毒介導(dǎo)的E2F-1調(diào)控可抑制MGC-803胃癌細胞的增殖[11]。E2F-1在結(jié)腸癌中的也有較多的相關(guān)研究。E2F-1通過激活包括染色體DNA復(fù)制及其自身啟動子在內(nèi)的多個基因來調(diào)節(jié)細胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)變[12]?；钚匝?磷酸肌醇3-激酶/AKT途徑激活，E2F-1表達上調(diào)，并介導(dǎo)結(jié)腸癌細胞增殖[13]。此外，在p53缺陷的人結(jié)腸癌細胞中，Mdm2抑制可通過激活Siva-1和PUMA的E2F-1和p73介導(dǎo)的蛋白表達而觸發(fā)細胞凋亡[14]。

盡管E2F-1在某些癌癥的發(fā)生和預(yù)后中已被證實發(fā)揮了作用，但是進一步生物信息學(xué)分析仍有待進一步研究。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)E2F-1在結(jié)腸癌中的蛋白表達顯著增高，但是E2F-1表達水平與腫瘤的分期不存在關(guān)聯(lián)[2]。轉(zhuǎn)染E2F-1質(zhì)粒后，E2F-1穩(wěn)定過表達的LoVo結(jié)腸癌細胞繁殖收到抑制。從實驗結(jié)果的表面意義看，E2F-1在體外試驗中可能對結(jié)腸癌有抑癌作用。但是結(jié)合E2F-1在其他腫瘤中的矛盾表現(xiàn)，我們認為直接認定E2F-1為抑癌基因是有爭議的。因為E2F-1在細胞轉(zhuǎn)錄周期中是以細胞內(nèi)“基因表達閥門”的身份存在的，其在腫瘤中的作用是透過其下游基因表達產(chǎn)物來實現(xiàn)的，沒有證據(jù)表面E2F-1表達產(chǎn)物直接參與細胞周期進展調(diào)節(jié)。例如：在腫瘤細胞中改變E2F-1的表達平衡，受E2F-1調(diào)控的多種促凋亡基因[15]活化，促使腫瘤細胞進入凋亡程序[16-17]。

因此，確定E2F-1介導(dǎo)的細胞周期進展、細胞凋亡和許多其他關(guān)鍵生理過程的主要機制，揭示E2F-1及其靶基因體系或網(wǎng)絡(luò)與不同類型的人類腫瘤的關(guān)系，可能揭示新的腫瘤治療策略。此外，許多研究證實了E2F-1和E2F家族其他成員與癌癥患者的臨床病理特征和生存結(jié)局之間的存在顯著相關(guān)性[18-19]，表明E2F-1有可能成為特定腫瘤的預(yù)測性腫瘤標記物[20]。