余 丹，黃小麗，鄧 卉，馮 楊，李 斌，鄒成義 ，屈 東

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院飼料研究所，四川 成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】芥子堿是以菜籽粕為代表的十字花科類飼料資源的重要次生代謝產(chǎn)物[1]，易被動(dòng)物腸道微生物降解為腥味物質(zhì)，誘發(fā)畜禽的魚腥味綜合征，嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品品質(zhì)和人類健康[2]；它味道苦澀，是脫除了硫甙的菜籽產(chǎn)品適口性較差的主要原因，嚴(yán)重影響動(dòng)物采食量[3]；它可與蛋白質(zhì)結(jié)合降低蛋白質(zhì)的消化吸收率[4]；芥子堿的抗雄激素活性能抑制精子成熟，引起動(dòng)物生殖功能障礙[5]。隨著雙低菜籽粕的推廣和應(yīng)用，以芥子堿為代表的多酚類物質(zhì)已成為菜籽粕最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子[6]。因此，探索和研究芥子堿的降解和消減技術(shù)，不僅有利于十字花科類地方特色飼料資源的開發(fā)和利用，更有利于減少我國(guó)飼料工業(yè)對(duì)大豆粕等大宗飼料原料的依存度，為我國(guó)飼料工業(yè)穩(wěn)定發(fā)展做出貢獻(xiàn)。【前人研究進(jìn)展】利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶蛋白降解芥子堿，是目前解決芥子堿抗?fàn)I養(yǎng)問題最有效最安全的方法[7]。降解芥子堿的微生物包括真菌和細(xì)菌[8-9]。相對(duì)于真菌而言，細(xì)菌基因簡(jiǎn)單，新陳代謝旺盛，培養(yǎng)條件要求不高，能夠在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，更有利于商業(yè)化生產(chǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本項(xiàng)目組近年來專注于芥子堿及其降解菌的研究，通過以芥子堿為唯一碳源的培養(yǎng)基，已成功篩選出了一些芥子堿降解效率較高的微生物[10]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些微生物對(duì)芥子堿的降解可能與一些含銅酶有關(guān)。但是，經(jīng)種屬鑒定和安全性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，部分菌種屬于條件性致病菌，不能直接應(yīng)用于生產(chǎn)[11-12]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)擬通過研究芥子堿、硫酸銅以及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)項(xiàng)目組前期篩選出的一株芥子堿降解優(yōu)勢(shì)菌 (Sinapine-degrading Bacteria 1,SDB1)相關(guān)酶活力的影響，初步確定SDB1中可能參與芥子堿降解的酶類以及影響酶活的因素，旨在為進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 芥子堿降解菌 芥子堿降解菌(SDB1)是四川省畜牧科學(xué)研究院畜禽飼料資源開發(fā)項(xiàng)目組前期以芥子堿為唯一碳源，分離培養(yǎng)的一株芥子堿降解優(yōu)勢(shì)菌，為肺炎克雷伯氏菌屬。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑包括：芥子堿硫氰酸鹽(購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司，芥子堿含量為80 %)；β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定試劑盒(A031)、脂肪酶活性測(cè)定試劑盒(A054)、淀粉酶活性測(cè)定試劑盒(C016)、多酚氧化酶活性測(cè)定試劑盒(A136)和膽堿酯酶活性測(cè)定試劑盒(A023)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；漆酶活性測(cè)試盒(BC1635)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 芥子堿降解菌的富集培養(yǎng)

使用平板劃線法，于優(yōu)化的腦心浸液瓊脂(BHI)培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)SDB1。培養(yǎng)溫度27 ℃，培養(yǎng)時(shí)間12 h。培養(yǎng)基組成:牛腦200.0 g,牛心浸出汁250.0 g,胰蛋白胨、葡萄糖和酵母提取物適量,NaCl5.0 g,瓊脂20.0 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.8～7.2。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從SDB1富集培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落接種于SDB1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。產(chǎn)酶培養(yǎng)基共分為1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)處理組，每組4個(gè)重復(fù)。對(duì)照組培養(yǎng)基組成為：NaNO33.0 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO40.01 g；胰蛋白胨和蔗糖適量；水 1000 mL。第1組和第2組是分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.50和1.00 g/L的芥子堿硫氰酸鹽(折算成芥子堿分別為0.40和0.80 g/L)，第3組和第4組為分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1.00和3.00 mM/L的五水硫酸銅(表2)。培養(yǎng)基配置好后，調(diào)整pH至7.0～7.5，并將每組培養(yǎng)基分裝至4個(gè)500 mL錐形瓶中(250 mL/瓶)作為4個(gè)重復(fù)，置于27 ℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 菌液收集及處理

取培養(yǎng)第2，4，6，8天的培養(yǎng)液各30 mL菌液，在3000 r/min的條件下離心5～10 min，移除上清液(盡量去除干凈)，加入PBS液10 mL，使細(xì)菌充分重懸于PBS液中。在4 ℃、12 000 r/min的條件下高速離心15 min，收集離心后的上清液，將上清液保存于-20 ℃冰箱中。

1.5 SDB1酶活性鑒定

參照β-葡萄糖苷酶、脂肪酶、淀粉酶、漆酶、多酚氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性測(cè)試盒操作說明書進(jìn)行相關(guān)酶活力測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表述，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS v.20.0，IBM Corp.，Armonk，New York，USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用t檢驗(yàn)對(duì)處理組與對(duì)照組之間的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1淀粉酶活力的影響

由表2可知，SDB1具有一定的淀粉酶活性。與對(duì)照組相比，添加0.40 g/L芥子堿，在培養(yǎng)的第2、4、6天，淀粉酶活力均沒有顯著變化，而在培養(yǎng)到第8天時(shí)，淀粉酶的活力卻顯著高于對(duì)照組，是對(duì)照組的2.32倍(P<0.05)；添加0.80 g/L芥子堿對(duì)SDB1淀粉酶活力沒有顯著影響，但在培養(yǎng)的第4、6、8天，淀粉酶活力均有提高的趨勢(shì)。此外，添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對(duì)SDB1淀粉酶活力均沒有顯著影響，但培養(yǎng)到第4天時(shí)2個(gè)組的SDB1淀粉酶活力均有增加的趨勢(shì)。

2.2 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1多酚氧化酶活力的影響

由表3可知，SDB1具有多酚氧化酶活性。盡管與對(duì)照組相比，添加0.40 g/L芥子堿對(duì)SDB1多酚氧化酶活力沒有顯著影響，但數(shù)值上，多酚氧化酶活力有隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而提高的趨勢(shì)；添加0.80 g/L芥子堿在培養(yǎng)的第2和4天，多酚氧化酶活性極顯著高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組增加了75.70 %(P<0.01)和197.03 %(P<0.01)。添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對(duì)SDB1多酚氧化酶活力均沒有顯著影響。

2.3 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1β-葡萄糖苷酶活力的影響

由表4可知，SDB1幾乎不具有β-葡萄糖苷酶活性。與對(duì)照組相比，添加0.40和0.80 g/L的芥子堿對(duì)SDB1β-葡萄糖苷酶活力均沒有顯著影響。添加1.00和 3.00 mmol/L的硫酸銅對(duì)SDB1中β-葡萄糖苷酶活力均沒有影響。

19.緊扣重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)開展集中宣傳。鼓勵(lì)探索重要節(jié)點(diǎn)開展法治宣傳的新模式，充分利用“4·26”知識(shí)產(chǎn)權(quán)日、憲法宣傳周等時(shí)間點(diǎn)，選取民營(yíng)企業(yè)關(guān)注的法律法規(guī)或法律熱點(diǎn)問題，集中開展大型的普法宣傳活動(dòng)，借助重要節(jié)點(diǎn)影響力進(jìn)一步提升普法效果，提高工作覆蓋面，傳播法律知識(shí)，弘揚(yáng)法治精神。

表2 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1淀粉酶活力的影響

注：同行肩注無*表示不顯著(P>0.05)，有*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，有**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，下同。

Notes：In the same row, values with no asterisk superscripts mean no significant difference (P>0.05)between the control group and the treatment groups, while with one asterisk(*) superscripts mean significant difference (P<0.05) between the control group and the treatment groups, and with two asterisk (**) superscripts mean very significant difference (P<0.01) between the control group and the treatment groups. The same as below.

表3 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1多酚氧化酶活力的影響

表4 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.4 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1漆酶活力的影響

由表5可知，SDB1具有較高的漆酶活性，且漆酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。與對(duì)照組相比，添加0.40和0.80 g/L的芥子堿均可以提高SDB1漆酶活力，其中添加0.40 g/L的芥子堿，在培養(yǎng)第4天，SDB1漆酶活力極顯著提高，是對(duì)照組的6.25倍(P<0.01)；添加0.80 g/L的芥子堿，漆酶活力在培養(yǎng)第4和6天均極顯著提高，在培養(yǎng)的第8天也顯著提高，分別為對(duì)照組的5.92倍(P<0.01)、3.03倍(P<0.01)和5.70倍(P<0.05)。添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對(duì)SDB1漆酶活力均沒有顯著影響。

2.5 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1乙酰膽堿酯酶活力的影響

由表6可知，SDB1具有一定的乙酰膽堿酯酶活性。與對(duì)照組相比，添加0.40 g/L的芥子堿對(duì)SDB1乙酰膽堿酯酶活力沒有影響；添加0.80 g/L的芥子堿，乙酰膽堿酯酶的活性在培養(yǎng)第6天時(shí)顯著降低，其余培養(yǎng)時(shí)間沒有顯著變化。添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對(duì)SDB1乙酰膽堿酯酶活力沒有顯著影響。

2.6 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1脂肪酶活力的影響

由表7可知，SDB1具有一定的脂肪酶活性。與對(duì)照組相比，添加0.40和0.80 g/L的芥子堿以及1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅對(duì)SDB1脂肪酶活力均沒有顯著影響。

3 討 論

芥子堿是芥子酸與膽堿形成的酯類化合物，其化學(xué)名稱為4-羥基-3,5二甲氧基苯丙烯膽堿酯。從分子結(jié)構(gòu)看，芥子堿的降解有3個(gè)潛在的活性位點(diǎn)：酯基、苯環(huán)上的酚羥基和碳碳雙鍵。酯鍵可以直接水解為芥子酸和膽堿；酚羥基可能發(fā)生氧化反應(yīng)形成醛酮或者醌類物質(zhì)，雙鍵也可能發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)[13]。近年來，芥子堿的微生物降解研究主要集中在真菌上：肖翼[14]用米曲霉固態(tài)發(fā)酵法有效脫除了菜籽粕中的芥子堿和多酚。Lacki[15-16]用白腐真菌有效降解了菜粕芥子堿的含量。Rozan[17]采用少孢根霉也成功降解了菜籽粕30 %的酚類物質(zhì)。周浩宇[8]用釀酒酵母、納豆芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌B4混合發(fā)酵菜籽餅粕，使菜籽粕中的芥子堿降解率達(dá)到80.06 %。而鈕琰星[13]指出釀酒酵母無論是液態(tài)發(fā)酵還是固態(tài)發(fā)酵都對(duì)菜籽粕芥子堿含量沒有顯著影響。本試驗(yàn)采用的SDB1為項(xiàng)目組前期分離培養(yǎng)的一株芥子堿降解優(yōu)勢(shì)菌，與項(xiàng)目組前期報(bào)道的芥子堿降解菌均為肺炎克雷伯氏菌屬[10]，具有顯著的芥子堿降解效果。與前人報(bào)道不同的是，SDB1屬于細(xì)菌類微生物。與真菌相比，細(xì)菌基因簡(jiǎn)單，新陳代謝旺盛，培養(yǎng)條件要求不高，能夠在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，具有潛在的優(yōu)勢(shì)。

表5 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1漆酶活力的影響

表6 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1乙酰膽堿酯酶活力的影響

表7 芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1脂肪酶活力的影響

微生物降解芥子堿的實(shí)質(zhì)是其分泌的生物酶對(duì)芥子堿的降解。目前研究較多的酶包括多酚氧化酶、漆酶、酪氨酸酶、單寧酸酶、阿魏酸酯酶、β-葡萄糖苷酶和脂肪酶等[18-20]。多酚氧化酶是自然界中分布極廣的一類氧化還原酶，是目前已知的可以有效降解芥子堿的主要酶系。Lacki指出白腐真菌分泌的多酚氧化酶可以有效降解芥子堿，其降解效果與溫度、pH和氧氣濃度有關(guān)。用相同的酶降解芥子酸也會(huì)出現(xiàn)類似的結(jié)果[15-16]，說明多酚氧化酶對(duì)芥子堿的作用位點(diǎn)可能在芥子堿中芥子酸的部分。本試驗(yàn)對(duì)照組多酚氧化酶活力在數(shù)值上隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而提高，說明SDB1具有多酚氧化酶活性。添加0.40 g/L芥子堿的后，盡管多酚氧化酶活力與對(duì)照組相比沒有顯著差異，但是在數(shù)值上提高的趨勢(shì)明顯，到培養(yǎng)的第8天時(shí)，已經(jīng)達(dá)到對(duì)照組的2.11倍。而當(dāng)芥子堿的添加量達(dá)到0.80 g/L時(shí)，多酚氧化酶的活性在培養(yǎng)的第4和6天極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，說明芥子堿作為底物充分激活了SDB1的多酚氧化酶。作為一種銅依賴性蛋白，多酚氧化酶活性受銅離子影響較大，但本試驗(yàn)添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅，對(duì)SDB1多酚氧化酶活性卻沒有顯著影響，原因有待進(jìn)一步研究。

微生物來源的多酚氧化酶主要是漆酶和酪氨酸酶[21]。漆酶是多酚氧化酶中作用底物最廣的一類。Hu研究了固態(tài)發(fā)酵過程中的漆酶活性和芥子堿的含量，發(fā)現(xiàn)漆酶的產(chǎn)生對(duì)芥子堿含量的降低具有顯著作用[22]。微生物漆酶按來源分為真菌漆酶和細(xì)菌漆酶[23]。真菌漆酶廣泛存在于多孔菌、脈孢菌、曲霉菌等真菌屬中, 其中擔(dān)子菌中的白腐菌漆酶研究最多[24]。鈕琰星[13]的研究指出來源于云芝菌的漆酶對(duì)菜籽粕芥子堿具有顯著的酶解作用，且漆酶的反應(yīng)活性位點(diǎn)是苯環(huán)的酚羥基。細(xì)菌漆酶研究不如真菌漆酶深入，目前的報(bào)道以芽孢桿菌屬為主，生脂固氮螺菌、鏈霉菌、大腸桿菌等細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)過漆酶活性[25]。與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶可能具有更多的優(yōu)點(diǎn), 如它具有Cu2+抗性[26]、不需糖基化、熱穩(wěn)定性好[27]、最適pH值范圍廣[28]等。因此, 細(xì)菌漆酶的應(yīng)用前景更為廣闊。本試驗(yàn)采用的SDB1就屬于細(xì)菌類微生物，試驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組漆酶活力在數(shù)值上隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而提高，第8天的漆酶活力為第2天的2.65倍，說明SDB1具有較強(qiáng)的漆酶活性。該結(jié)果也為細(xì)菌漆酶驗(yàn)證了一位新成員。添加0.40或0.80 g/L芥子堿后，SDB1的漆酶活力在培養(yǎng)的第4天到第8天內(nèi)顯著或極顯著高于與對(duì)照組(P<0.01)，說明芥子堿作為底物充分激活了SDB1的漆酶。與多酚氧化酶相同，漆酶是一類典型含銅糖蛋白，銅離子是其催化反應(yīng)的活性中心，因此其活性還會(huì)受銅離子含量直接影響。范晶晶[29]研究指出在培養(yǎng)基中添加0.50～4.00 mmol/L硫酸銅，均能提高SYBC starX菌(為Kocuria菌屬)的漆酶活性，其中最適Cu2+濃度為3.00 mmol/L。但是本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加1.00和3.00 mmol/L的硫酸銅后，SDB1漆酶活力卻沒有增加。目前研究較多的細(xì)菌漆酶是CotA蛋白，它來源于芽孢桿菌。汪春蕾證實(shí)CotA存在于芽孢桿菌的芽孢壁[30]，是一種銅依賴性蛋白[31]。Matthias將CotA蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)，除了胞內(nèi)銅離子濃度外，適宜的銅伴侶也是影響銅離子嵌入CotA蛋白分子并影響CotA活性的重要因素[32]。本試驗(yàn)中硫酸銅沒有增加漆酶和多酚氧化酶活性是否也與沒有響應(yīng)的銅伴侶有關(guān)，目前還不清楚，需要進(jìn)一步的研究。盡管芽孢桿菌漆酶是目前細(xì)菌漆酶的典型代表，但由于漆酶一般存在于芽孢桿菌的芽孢壁中，提取成本較高，在生產(chǎn)中應(yīng)用受限，因此篩選具有胞外產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的細(xì)菌，對(duì)于細(xì)菌漆酶的應(yīng)用具有十分重要的意義。本試驗(yàn)的SDB1漆酶就是一種胞外細(xì)菌漆酶，在推廣應(yīng)用上具有很大優(yōu)勢(shì)。

何江[20]的研究結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶和脂肪酶也參與菜籽粕芥子堿的降解，只是降解效果不如漆酶和多酚氧化酶。周浩宇[19]指出釀酒酵母中的β-葡萄糖苷酶可以降解17.65 %的菜籽粕芥子堿。本試驗(yàn)也研究了芥子堿和硫酸銅對(duì)SDB1的β-葡萄糖苷酶和脂肪酶的活性。結(jié)果對(duì)照組SDB1不具有β-葡萄糖苷酶活性，具有一定的脂肪酶活性。添加芥子堿和硫酸銅沒有顯著改變SDB1的β-葡萄糖苷酶和脂肪酶活性。由于現(xiàn)有大多數(shù)研究都是用菜籽粕替代芥子堿，僅僅是通過測(cè)定發(fā)酵前后菜籽粕芥子堿的含量變化來推測(cè)酶與芥子堿的關(guān)系，并沒有考慮菜籽粕復(fù)雜的物質(zhì)組成可能對(duì)酶活性和芥子堿含量產(chǎn)生的影響；而本試驗(yàn)是直接采用的芥子堿硫氰酸鹽(含量達(dá)80 %以上)，這可能是導(dǎo)致本試驗(yàn)結(jié)果與現(xiàn)有研究出現(xiàn)差異的原因之一。關(guān)于芥子堿與β-葡萄糖苷酶以及脂肪酶的關(guān)系目前報(bào)道極少，以上推測(cè)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

項(xiàng)目組前期的抑菌圈定性試驗(yàn)表明研究[10]表明：與SDB1同種屬的YD-1和YD-2均具有淀粉酶活性。本試驗(yàn)也進(jìn)一步考察了SDB1的淀粉酶活性，并研究了芥子堿和硫酸銅對(duì)淀粉酶活性的影響。結(jié)果SDB1具有一定的淀粉酶活性。添加0.40 g/L芥子堿，SDB1淀粉酶的活力在培養(yǎng)到第8天時(shí)顯著高于對(duì)照組；添加0.80 g/L芥子堿也有提高淀粉酶活力的趨勢(shì)。添加硫酸銅對(duì)SDB1淀粉酶活力沒有顯著影響。目前還未見其它關(guān)于芥子堿與淀粉酶活力關(guān)系的研究報(bào)道。結(jié)合本試驗(yàn)脂肪酶和淀粉酶的結(jié)果可以設(shè)想，當(dāng)SDB1用于消減十字花科類飼料資源中的芥子堿時(shí)，還有可能在一定程度上改善碳水化合物和脂類養(yǎng)分的消化利用率，從而多方面改善飼料品質(zhì)。

4 結(jié) 論

(1) 本試驗(yàn)條件下，SDB1具有一定的淀粉酶、多酚氧化酶、漆酶、乙酰膽堿酯酶和脂肪酶的活性，不具有β-葡萄糖苷酶的活性。

(2)本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)基中添加芥子堿，可以在培養(yǎng)的4～8 d內(nèi)不同程度的提高SDB1淀粉酶、多酚氧化酶、漆酶活性；芥子堿添加量越高，多酚氧化酶和漆酶活力越高；添加芥子堿對(duì)SDB1的β-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、脂肪酶活性沒有顯著影響。

(3) 本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)基中添加硫酸銅對(duì)SDB1的淀粉酶、多酚氧化酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶和脂肪酶活性均沒有顯著影響。