屠平光，項(xiàng) 云，章嘯君，胡旭進(jìn)

(金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321007)

胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)是一種體外受精技術(shù)，對(duì)于受精機(jī)理的研究、野生動(dòng)物和瀕臨滅絕動(dòng)物的保護(hù)、優(yōu)秀公畜精子的利用，以及男性不育的治療等方面具有重要意義。2000年，Martin采用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞經(jīng)ICSI首次得到存活的小豬。與其他物種相比，豬ICSI技術(shù)還不完善。由于ICSI避開了傳統(tǒng)受精的精卵結(jié)合激活卵母細(xì)胞的過程，因此，與傳統(tǒng)的受精過程不同[1]，胞質(zhì)內(nèi)顯微受精不進(jìn)行激活處理的卵母細(xì)胞，其體外發(fā)育率很低，不能發(fā)育到囊胚階段，說(shuō)明注射管的機(jī)械刺激不足以激活卵子[2]。而卵母細(xì)胞激活失敗是ICSI受精失敗的主要原因[3]。因此，卵母細(xì)胞激活對(duì)提高卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射的成功率具有重要作用[4-5]。不同的激活方法、激活劑的選擇，對(duì)卵子激活后的卵裂率、囊胚發(fā)育率均有較大程度影響。本試驗(yàn)研究了采用不同激活方法對(duì)金華豬ICSI胚胎體外發(fā)育的影響，為后期開展核移植提供足量、優(yōu)質(zhì)的胚胎和高效、穩(wěn)定的激活方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 試驗(yàn)所用試劑除特別說(shuō)明外，均為sigma公司產(chǎn)品。卵母細(xì)胞成熟液為TCM-199基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10%PFF+10%血清；融合/激活液由0.25 mol/L甘露醇，0.1 mmol/L氯化鈣，0.1 mmol/L氯化鎂，0.5 mmol/L HEPES以及0.01%PVA組成；胚胎培養(yǎng)液為NCSU-23+4 mg/mL BSA+10%血清。體視顯微鏡(Olympus TRPT-4045型)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo311)；倒置顯微鏡(Olympus-CKX41)。

1.2金華豬卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后，放入含有0.1%透明質(zhì)酸酶的洗卵液中，輕輕地用吸管吹打去掉顆粒細(xì)胞，挑選胞質(zhì)飽滿均勻、排出pbI的卵母細(xì)胞，用TCM-199培養(yǎng)液和獲能液 (mTBM)洗3次，移入已平衡的mTBM微滴(50 μL)中，上覆石蠟油。每滴置卵母細(xì)胞18枚左右，放入CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.3金華豬精子的準(zhǔn)備 將新鮮采集的精液迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,用預(yù)熱到37℃的BTS洗精液稀釋,精子獲能取0.5 mL稀釋精液小心置于含有5 mL mTBM受精液的圓底試管底部,懸浮30 min后,將上層液吸出,離心洗滌及濃縮一次,取BTS重懸,使其濃度為1×106個(gè)/mL。按照精子預(yù)處理方法的不同,對(duì)重懸稀釋的精子進(jìn)行處理。(1)新鮮精子顯微操作:直接移動(dòng)BTS稀釋的精子2 μL放置到準(zhǔn)備好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盤中備用。(2)液氮一次凍融:用精液冷凍保護(hù)液稀釋精液分裝于0.5 mL細(xì)管中,放入液氮冷凍保存。用時(shí)60 ℃解凍,吸取2 μL放置到準(zhǔn)備好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盤中備用。然后再離心沉淀，用BTS重懸至精子濃度為1×106個(gè)/mL,吸取2 μL放置到準(zhǔn)備好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盤中備用。

1.4單精子顯微注射受精(ICSI) 將精子加入ICSI培養(yǎng)皿中,選擇一條活動(dòng)力強(qiáng)、形態(tài)正常的精子，用注射針在精子尾部中下段，于尾部垂直按壓，用力制動(dòng)，將精子斷尾部后，頭部吸入注射針內(nèi)，旋轉(zhuǎn)微調(diào)升起降下注射針，將卵母細(xì)胞的極體置于12點(diǎn)或6點(diǎn)處固定。調(diào)節(jié)注射針在3點(diǎn)處，并緊貼卵膜。旋轉(zhuǎn)針?biāo)?將精子緩慢推向針頭，當(dāng)精子到達(dá)末端時(shí)，小心進(jìn)針避免將卵子后壁損壞?；匚倭柯褲{，卵膜破裂后，將精子注入卵漿。若卵膜破裂仍不明顯，來(lái)回吸動(dòng)卵漿，直到卵膜破裂后連同精子注入卵漿。精子注入卵漿內(nèi)之前,必須抽吸少量卵漿,促進(jìn)流入,增進(jìn)卵母細(xì)胞激活。注射精子后，移出注射針，釋放卵子，持卵針離開液滴，注射針離開皿底部。

1.5ICSI卵母細(xì)胞激活處理 注射卵在胚胎培養(yǎng)液滴中洗 3 遍后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30 min，再依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)注射卵采用不同的輔助激活方法分四組處理：對(duì)照組，不激活；電激活組，采用 1.2 kV/cm，30 μs，2 次直流電(DC)脈沖；化學(xué)激活組，ICSI操作的卵子放入到添加了2 mol/L的6-DMAP作為激活劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h；電+化學(xué)激活組，ICSI電激活后，在NCSU-23中培養(yǎng)4 h，然后轉(zhuǎn)入到添加了2 mol/L的6-DMAP作為激活劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h。

1.6計(jì)算胚胎體外培養(yǎng)及發(fā)育率 金華豬ICSI卵母細(xì)胞培養(yǎng)于NCSU-23胚胎培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為 38.5 ℃，5% CO2、及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2 d 統(tǒng)計(jì)卵裂胚胎數(shù),第7 d再次進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育情況。

1.7數(shù)據(jù)分析 用Graphpad Prism 5軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1不同激活方法對(duì)金華豬ICSI胚胎發(fā)育的影響 由表1可知，不同激活處理組與對(duì)照組比較，在卵裂率上無(wú)顯著差異(P>0.05)，但在囊胚率上，電+化學(xué)激活組和電激活組與對(duì)照組和化學(xué)激活組比較，存在顯著差異(P<0.05)。電+化學(xué)激活組和電激活組在囊胚率上無(wú)顯著差異 (P>0.05)，對(duì)照組和化學(xué)激活組在囊胚率上無(wú)顯著差異 (P>0.05)。

表1 不同激活方法對(duì)金華豬ICSI胚胎發(fā)育的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0．05)，肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2精子不同處理方法對(duì)豬ICSI胚胎發(fā)育的影響 由表2可知，新鮮精子和冷凍精子經(jīng)ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 精子不同處理方法對(duì)金華豬ICSI胚胎發(fā)育的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

目前，常用的激活方法有化學(xué)激活和電激活，通常電激活與化學(xué)物質(zhì)6-DMAP等聯(lián)合應(yīng)用，其激活效果更好。6-DMAP是一種蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑，它能阻止蛋白質(zhì)磷酸化，能抑制成熟促進(jìn)因子(MPF)和細(xì)胞靜止因子(CSF)活性,從而使卵母細(xì)胞被激活,同時(shí)6-DMAP通過抑制紡錘體組裝必須的磷酸化，導(dǎo)致紡錘體解聚，抑制第二極體排出，使卵母細(xì)胞形成二倍體雌原核[6]。因此，在ICSI卵母細(xì)胞經(jīng)電激活處理和6-DMAP激活處理之間，有一個(gè)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，能夠有效的減少出現(xiàn)二倍體雌原核和孤雌發(fā)育的情況。電激活的原理是細(xì)胞在短暫高壓直流電脈沖的作用下，膜上產(chǎn)生暫時(shí)的微孔，使細(xì)胞外鈣離子通過微孔內(nèi)流。Rho等研究表明，在ICSI卵經(jīng)第1次激活后培養(yǎng)3 h后，再用6-DMAP處理,有利于第二極體的排出[7]。

本試驗(yàn)先用電激活I(lǐng)CSI卵母細(xì)胞，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h后，此時(shí)大部分ICSI卵母細(xì)胞已排出第二極體，再用6-DMAP激活，促進(jìn)了原核的形成，并有效的避免了6-DMAP對(duì)第二極體排放的抑制作用，得到了較高的囊胚率。結(jié)果顯示：新鮮精子和冷凍精子經(jīng)ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上無(wú)顯著差異(P>0.05)。電+化學(xué)激活組和電激活組與對(duì)照組和化學(xué)激活組比較，在囊胚率上均差異顯著(P<0.05)。電+化學(xué)激活組在囊胚率上稍高于電激活組，但無(wú)顯著差異 (P>0.05)，都可用于金華豬ICSI卵子激活的方法。