廖華媛 張古月 龍 劍 李潤(rùn)成

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128

雞大腸桿菌病是由大腸埃希菌某些致病性菌株引起的，可產(chǎn)生不同的臨床表現(xiàn)，如死胚、敗血癥、腦膜炎、全眼球炎、腹膜炎等[1]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，該病已成為困擾養(yǎng)雞場(chǎng)的重要疾病之一。由于該菌在環(huán)境中廣泛存在，且血清型較多，雞只是否出現(xiàn)發(fā)病通常與雞群的健康水平存在很大關(guān)系，飼養(yǎng)環(huán)境差、應(yīng)激或其他病原的感染可導(dǎo)致雞群發(fā)生大腸桿菌病。此外，由于抗菌藥物的盲目使用，致使大腸桿菌耐藥菌株越來(lái)越多[2-4]，造成該病的臨床治療難度增加，常給養(yǎng)雞場(chǎng)帶來(lái)巨大損失。

2019年12月，衡陽(yáng)某養(yǎng)雞場(chǎng)有3 棟雞舍，共約7 000 羽70～80日齡的肉雞。陸續(xù)有雞只發(fā)病，每天死亡30～40 羽不等。本文收集典型發(fā)病雞進(jìn)行臨床解剖觀(guān)察、實(shí)驗(yàn)室診斷，并結(jié)合診斷結(jié)果采取了綜合性防控措施，取得了明顯效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基為oxid 生產(chǎn)，麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，無(wú)菌脫纖綿羊血購(gòu)自鄭州益康生物工程有限公司，PCR MIX 購(gòu)于北京天恩澤生物技術(shù)有限公司，6 種不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的獸藥（阿莫西林克拉維酸鉀粉末、硫酸慶大霉素可溶性粉、阿米卡星粉末、2 個(gè)不同廠(chǎng)家的頭孢噻呋鈉粉、新霉素可溶性粉）來(lái)自發(fā)病雞場(chǎng)。

1.2 病雞的臨床解剖

從發(fā)病雞場(chǎng)選取具有代表性臨床癥狀的病雞3只，采用常規(guī)方法進(jìn)行解剖，同時(shí)根據(jù)臨床解剖情況采集主要病變臟器進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定

采用無(wú)菌操作，從3 只雞病變臟器取組織劃線(xiàn)接種用BHI 加綿羊血制備的巧克力色營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)12 h 后觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并根據(jù)菌落形態(tài)取數(shù)量上具有優(yōu)勢(shì)的代表性菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和培養(yǎng)特性分析。最后，根據(jù)培養(yǎng)特性和鏡檢情況確定疑似菌種，采用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，引物參照文獻(xiàn) [5]，上游引物為F 5'－ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGG－3'，下游引物為R 5'－GGTTTATGCAGCAACGAGACGTC－3'。

1.4 分離菌的藥物敏感性檢測(cè)

取分離的優(yōu)勢(shì)菌株混合，用紙片法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，并參照藥敏紙片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果的判定。

1.5 商品化獸藥對(duì)分離菌的抑制試驗(yàn)

1）用BHI 培養(yǎng)基將雞場(chǎng)現(xiàn)有獸藥阿莫西林克拉維酸鉀粉、硫酸慶大霉素粉、硫酸新霉素粉、來(lái)自2 個(gè)不同廠(chǎng)家的頭孢噻呋鈉粉、硫酸阿米卡星粉（各產(chǎn)品說(shuō)明標(biāo)注使用濃度為0.1～0.5 g 粉末/L 水或kg飼料）均按0.1 g/mL 稀釋。

2）于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1～6 行的第1 孔分別加稀釋好的不同藥液200 μL/孔，然后每一行的第

2～12 孔分別加BHI 培養(yǎng)基100 μL/孔。

3）分別從各行的第1 孔取100 μL 至第2 孔混勻，再取100 μL 加入第3 孔依次加至第12 列后棄掉100 μL，將藥液梯度稀釋。

4）將分離菌培養(yǎng)液調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠁挝粷舛?，然后每孔加?0 μL，各行的第12 孔不加菌液，作為是否存在操作污染對(duì)照孔。

5）將培養(yǎng)板蓋好放入37 ℃溫箱孵育，0、6、24 h 各測(cè)定1 次OD600值。

1.6 防控方案的制定

根據(jù)臨床情況結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，采取針對(duì)性措施，然后進(jìn)行防控效果的評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床解剖觀(guān)察

臨床觀(guān)察發(fā)病雞表現(xiàn)呆立、精神沉郁（圖1），解剖3 只死亡病雞，2 只可見(jiàn)干酪樣物質(zhì)包心、包肝（圖2），肺臟有出血和干酪樣物質(zhì)黏附（圖3），1 只病雞肝臟有白色壞死點(diǎn)（圖4），3 只病雞腹腔均有干酪樣物質(zhì)存在。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定

無(wú)菌操作取3 只病死雞肝臟組織劃線(xiàn)接種巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)12 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂均長(zhǎng)滿(mǎn)灰白色、菌落形態(tài)一致的細(xì)菌，代表性結(jié)果見(jiàn)圖5。從3 個(gè)巧克力營(yíng)養(yǎng)瓊脂中分別隨機(jī)挑選6 個(gè)單菌落，共18 個(gè)菌落劃線(xiàn)接種麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂，結(jié)果18 個(gè)菌落來(lái)源的細(xì)菌均長(zhǎng)成粉紅色菌苔。取菌苔液體增菌培養(yǎng)后革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)紅色桿狀細(xì)菌（圖6）。采用大腸桿菌鑒定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果均擴(kuò)增出了預(yù)期大小的特異性條帶（圖7）。

2.3 分離菌藥物敏感性檢測(cè)

取分離菌的不同菌落混合后調(diào)整菌液濃度至0.5 麥?zhǔn)蠁挝粷舛?，然后采用紙片法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，分離菌對(duì)新霉素、多粘菌素B、慶大霉素、阿米卡星、頭孢曲松、頭孢噻肟、呋喃唑酮比較敏感，但對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林等耐藥。

2.4 雞場(chǎng)獸藥抑菌效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)

用雞場(chǎng)提供的獸藥，稀釋至最高濃度100 g/L、最低濃度為0.001 μg/L，然后進(jìn)行分離菌的培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，培養(yǎng)板各行的對(duì)照孔（第12 孔）均沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明不存在操作污染的影響；A、B、C、E、F 號(hào)藥物所有稀釋度均能有效抑制分離菌的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)24 h 后，各培養(yǎng)孔均沒(méi)有出現(xiàn)OD600值的變化；D 號(hào)藥物慶大霉素，所有孔均出現(xiàn)OD600數(shù)值的增加，說(shuō)明該藥物對(duì)分離菌沒(méi)有抑制作用（為確定各藥物檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行了再一次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果仍然相同）。

圖1 病雞呆立精神沉郁

圖2 心臟、肝臟布滿(mǎn)黃色干酪樣物質(zhì)

圖3 肺臟出血、附有干酪樣物質(zhì)

圖4 肝臟有白色壞死點(diǎn)

圖5 肝臟組織細(xì)菌分離結(jié)果

圖6 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

圖7 分離菌PCR 鑒定結(jié)果

2.5 防控措施

根據(jù)藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果，給雞群采用飼料中添加阿莫西林克拉維酸鉀、飲水中添加新霉素，連用4 d，結(jié)果該雞場(chǎng)3 棟雞舍中的1 棟雞舍很快控制了疫情，但另外2 棟未能達(dá)到理想的防控效果。調(diào)查原因可能為另外2 棟雞舍裝有水簾、水簾上縫隙未進(jìn)行密封，雞舍溫度較低，且該2 棟雞舍在轉(zhuǎn)群時(shí)谷殼墊料較薄。后來(lái)將水簾進(jìn)行密封，并更換墊料，同時(shí)增加墊料的厚度，再采用硫酸粘桿菌素拌料、頭孢噻呋鈉可溶性粉末飲水飼喂3～4 d，雞群逐漸康復(fù)。

表1 分離菌藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果

表2 培養(yǎng)24 h 后各藥物對(duì)分離菌的抑制情況

3 討 論

本文對(duì)某雞場(chǎng)出現(xiàn)雞群精神沉郁、拉稀，死亡的病例進(jìn)行了臨床分析以及細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果證實(shí)雞群存在大腸桿菌感染。通過(guò)采用商品化藥敏紙片進(jìn)行分離菌的藥物敏感性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分離菌存在較強(qiáng)的耐藥性，僅對(duì)慶大霉素、多粘菌素B、阿米卡星、新霉素、頭孢曲松等比較敏感。此外，本文采用雞場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的獸藥進(jìn)行分離菌藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)，阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻呋鈉、阿米卡星、新霉素均比較有效，但慶大霉素完全沒(méi)有效果，這與商品化藥敏紙片得到的結(jié)果存在差異。至于為什么不同來(lái)源相同成分藥物對(duì)同一株細(xì)菌抑制效果有差異，不排除存在某些藥物成分含量不夠或?qū)嶋H成分與標(biāo)識(shí)有差異的可能。因此，雞場(chǎng)在進(jìn)行細(xì)菌藥敏檢測(cè)時(shí)，選用購(gòu)買(mǎi)的獸藥進(jìn)行敏感性檢測(cè)對(duì)于保證用藥效果有時(shí)具有非常重要的作用。

本文根據(jù)藥敏檢測(cè)結(jié)果，選用敏感藥物進(jìn)行防控，結(jié)果條件較好的雞舍取得了預(yù)期效果，而環(huán)境條件差的雞舍未能取得理想效果，直到將水簾密封、提高雞舍溫度、更換墊料并增加其厚度、降低環(huán)境中病原含量、提高墊料保暖效果，才控制好發(fā)病情況?？梢?jiàn)，雞群大腸桿菌感染除采用敏感藥物進(jìn)行防治外，環(huán)境改善同樣是不可缺少的重要措施。