幾種發(fā)酵基質(zhì)對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響*

江勝滔，林美花

（1.寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352106；2.福建師范大學(xué)，福建 福州 350108）

食用菌菌糠（EFR）是在食用菌采摘后殘余的原料物質(zhì)，即菌渣、菌糠，經(jīng)過食用菌的生長，菌糠中所含有的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪等復(fù)合物都得到一定的提高[1-2]。菌糠是經(jīng)過食用菌的分解得到的農(nóng)業(yè)廢棄物，它是安全無毒的。寧德市古田縣是“中國食用菌之都”。食用菌產(chǎn)業(yè)是古田縣的支柱產(chǎn)業(yè)，全年產(chǎn)量高達(dá)87萬t、年產(chǎn)值超過58億元，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值超百億元。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，產(chǎn)生了大量的菌糠廢棄物，對環(huán)境造成了污染。

芽孢桿菌菌體自身能夠合成蛋白酶、淀粉酶，脂肪酶等酶類，飼料中添加芽孢桿菌粉劑可以提高飼料轉(zhuǎn)化率[3]，可以在消化道與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，出現(xiàn)“飼料便”等狀況，并且能明顯提高動物生長性能和飼料利用率[4]。因芽孢的營養(yǎng)體細(xì)胞易保存、存活率高，故通常選用芽孢桿菌作為微生物飼料添加劑發(fā)酵菌種[5]。目前，大部分的菌糠處理方式主要是有機(jī)肥化利用，有些也用在生物飼料的生產(chǎn)上。作為生產(chǎn)微生物飼料添加劑主要使用的發(fā)酵菌株，通常是一些外籍菌，而把大黃魚腸源芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，發(fā)酵菌糠生產(chǎn)飼料微生物添加劑的研究較少。鑒于此，本研究是利用自主分離篩選的大黃魚腸源芽孢桿菌LYC-1作為發(fā)酵菌株，研究不同的發(fā)酵基質(zhì)對其芽孢量的影響，為高值化利用食用菌菌糠和選擇合適的發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)動物微生物添加劑提供一些依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

芽孢桿菌LYC-1，本實驗室保存。

1.1.2 菌糠

三種無霉變腐爛的菇類的供試菌糠，由寧德柘榮縣菇場提供。具體如下：

金針菇菌糠（原栽培配方：棉籽殼38%，麩皮32%，淋水陳積雜木屑25%，玉米粉3%，輕質(zhì)碳酸鈣1.5%，過磷酸鈣0.5%）、杏鮑菇菌糠（原栽培配方：雜木屑75%、麩皮22%、糖1%、石灰1%、碳酸鈣1%）、猴頭菇菌糠（原栽培配方：棉籽皮82%，麥麩15%，尿素1%，石膏粉1%，過磷酸鈣1%）。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9146A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱，DNP-9052，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

高壓自動電熱滅菌鍋，LDZX-40511，上海申安醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺，5W-CJ-ZD，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.1.4 主要試劑

磷酸二氫鉀、碳酸鈣，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；

麩皮、玉米粉、豆粕粉，綠色食品農(nóng)村公司（周口）。

1.1.5 主要培養(yǎng)基

⑴ 活化培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂20 g/L、pH 7.0～7.2；121 ℃滅菌22 min。

⑵ 種子培養(yǎng)基[6]：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、pH 7.0～7.2；121 ℃，滅菌22 min。

⑶ 計數(shù)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，pH 7.0

⑷ 芽孢桿菌LYC-1的麩皮固體培養(yǎng)基：無水葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、麩皮80%、米糠5%、玉米粉5%、豆粕粉5%、磷酸二氫鉀0.3 %、碳酸鈣0.2%。

⑸ 菌糠固體培養(yǎng)基制備[7-8]

稱量各培養(yǎng)基成分混勻，每種菌糠（杏鮑菇、猴頭菇、金針菇）分別做三組培養(yǎng)基；按1∶1的比例每兩兩做培養(yǎng)基，這同樣有三組培養(yǎng)基；再按1∶1∶1的比例一起做一個培養(yǎng)基；共有7組培養(yǎng)基配方，每組再同時做3個組別。每組實驗組配方為菌糠80%、無水葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、米糠5%、玉米粉5%、豆粕粉5%、磷酸二氫鉀0.3%、碳酸鈣0.2%，含水量大約為60%。稱量40 g分別分裝到250 mL錐形瓶中，進(jìn)行包裝處理后在121 ℃下滅菌30 min。滅菌后取出冷卻至60～70 ℃，晃動錐形瓶，使培養(yǎng)基完全散開成顆粒狀，直至無塊狀為止，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌糠的處理

菌糠的加工方法：在食用菌采摘完后（一般收獲子實體2～3茬）后，把剩余的原料曬干，清理原料上的殘土，并去除霉變、污染的原料，選擇子實體及菌絲含量高、松軟、且氣味芳香的培養(yǎng)料，然后用粉碎機(jī)粉碎即成。

1.2.2 芽孢數(shù)的檢測

在無菌操作臺上操作，用電子天平稱取處理完成的菌糠25 g，置于研缽內(nèi)，加入225 mL無菌生理鹽水，研磨。研磨充分后，放置于無菌均質(zhì)器中，用速度為8000～10000 r/min混合1 min，形成1∶10的均勻稀釋液。再吸取此時的稀釋溶液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，搖勻，形成1∶100的稀釋液。

按照前面步驟重復(fù)稀釋至稀釋度分別為 10-5、10-6、10-7，以確保實驗的精確度[8-11]。每稀釋度各取菌液0.1 mL均勻涂布于LB培養(yǎng)基，每個稀釋度個3個平行，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.2.3 種子液的制備

從芽孢桿菌LYC-1的斜面中，用接種環(huán)挑取2環(huán)菌種接入液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，為種子液備用。

1.2.4 接種與培養(yǎng)

取種子液2 mL（接種量按培養(yǎng)基干重的5%[v/w]），于菌糠培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢杈鶆騕12]。將其轉(zhuǎn)入250 mL錐形瓶中，使各錐形瓶中料層厚度和重量均等，約為2 cm，40 g。后放置于37 ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，中間扣瓶翻料一次，再取樣測定發(fā)酵后的活菌數(shù)(CFU/ g)和芽孢數(shù)(CFU/ g)。

1.2.5 三種菌糠不同組合的菌糠對LYC-1芽孢數(shù)的影響

以腸源芽孢桿菌固體發(fā)酵常規(guī)培養(yǎng)基為對照組CK，以金針菇菌糠、猴頭菇菌糠、杏鮑菇菌糠為底物的培養(yǎng)基分別設(shè)為實驗組T1、T2、T3；金針菇菌糠與猴頭菇菌糠（1∶1）培養(yǎng)基設(shè)為實驗組T4；金針菇菌糠∶杏鮑菇菌糠（1∶1）培養(yǎng)基設(shè)為實驗組T5；猴頭菇菌糠與杏鮑菇菌糠（1∶1）培養(yǎng)基設(shè)為實驗組T6；金針菇菌糠、猴頭菇菌糠、杏鮑菇菌糠（1∶1∶1）比例配制培養(yǎng)基為T7。

再用這7種培養(yǎng)基，按1.2.4的方法接種與培養(yǎng)后，按1.2.2的方法測定它們的芽孢數(shù)，并選擇獲得芽孢數(shù)量最多的培養(yǎng)基為后續(xù)實驗的菌糠培養(yǎng)基作為對照組。

1.2.6 玉米粉不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

以1.2.5中實驗得到的糠菌培養(yǎng)基作為對照組，在糠菌培養(yǎng)基中分別額外添加2%、3%、4%、5%、6%五個梯度玉米粉，按1.1.5⑸方法處理后，作為5個實驗組，置入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，采用菌落計數(shù)法計算培養(yǎng)料中的芽孢數(shù)。以下同。

1.2.7 豆粕粉不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

豆粕粉分別以2%、3%、4%、5%、6%五個梯度額外添加，其余成分與1.2.5得到的糠菌培養(yǎng)基配方一致，配置固體發(fā)酵培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，計算培養(yǎng)料中的芽孢數(shù)。

1.2.8 米糠不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

米糠分別以2%、3%、4%、5%、6%五個梯度額外添加，其余成分與1.2.5得到的糠菌培養(yǎng)基配方一致，配置固體發(fā)酵培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，計算培養(yǎng)料中的芽孢數(shù)。

1.2.9 磷酸二氫鉀不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響 磷酸二氫鉀分別以0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4% 五個梯度額外添加，其余成分與1.2.5得到的糠菌培養(yǎng)基配方一致，配置固體發(fā)酵培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，計算培養(yǎng)料中的芽孢數(shù)。

1.2.10 碳酸鈣不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

碳酸鈣分別以0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%五個梯度額外添加，其余成分與1.2.5得到的糠菌培養(yǎng)基配方一致，配置固體發(fā)酵培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，計算培養(yǎng)料中的芽孢數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，實驗結(jié)果采用Excel 2007和SPSS 21.0版統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種菌糠不同組合的菌糠對LYC-1芽孢數(shù)的影響

由于三種不同的食用菌的栽培配料不同，不同菌糠和不同的菌糠組合含有的營養(yǎng)成分也不一樣，它們對芽孢桿菌LYC-1的菌體的生長、繁殖以及形成的芽孢量具有一定的影響。圖1表明，實驗組T1芽孢數(shù)最多，為(5.58±0.19)×109CFU/g；實驗組T2芽孢數(shù)最少，為(2.70±0.15)×109CFU/g；對照組CK為(4.99±0.63)×109CFU/g，實驗組T3、T4、T5、T6、T7的芽孢數(shù)分別為(4.48±0.83)×109CFU/g、(3.92±0.79)×109 CFU/g、(4.97±0.77)×109CFU/g、(3.68±0.59)×109 CFU/g、(3.92±0.68)×109CFU/g。與CK相比較，實驗組T2和T6的菌糠培養(yǎng)基對芽孢量的減少有顯著影響，而T1、T3、T4、T5、T7的菌糠培養(yǎng)基對芽孢量的減少沒有顯著影響，說明T2(猴頭菇菌糠)和T6（猴頭菇菌糠∶杏鮑菇菌糠=1∶1）的不宜替代麩皮固體培養(yǎng)基，而金針菇菌糠和杏鮑菇菌糠都可以替代麩皮。從圖1可知，T1芽孢量最多，故選擇金針菇菌糠為主要原料的菌糠培養(yǎng)基為對照組，研究其它基質(zhì)對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響程度。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)基與不同組合的菌糠培養(yǎng)基對腸源芽孢桿菌芽孢數(shù)的影響（109 CFU/g）

2.2 玉米粉不同的添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

在微生物的各種營養(yǎng)需求中，碳源既能滿足生物的合成需要，又能為細(xì)胞提供能量，對碳的需要量最大[13]。如圖2所示，芽孢桿菌LYC-1芽孢量從玉米粉添加量0%到5%之間，隨著添加量增加，芽孢量呈緩慢的增加趨勢，在5.0%時達(dá)到最大值，為(6.89±0.40)×109CFU/g，添加量超過5.0%時，芽孢量呈下降趨勢；與對照組相比較，玉米粉的添加量3.0%、4.0%、5.0% 、6.0%對芽孢桿菌LYC-1芽孢量具有顯著影響，而添加量為2.0% 時，芽孢量為(5.71±0.21)×109CFU/g，對芽孢桿菌LYC-1芽孢量沒有顯著影響。

圖2 玉米粉添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響

2.3 豆粕粉不同的添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

如圖3所示，芽孢桿菌LYC-1芽孢量從豆粕粉添加量0.0%到3.0%之間，隨著添加量增加，芽孢量呈快速增加趨勢，在3.0%時達(dá)到最大值，為(7.50±0.74)×109CFU/g，當(dāng)添加量超過3.0%時，芽孢量呈緩慢下降趨勢；與對照組相比較，豆粕粉的添加量3.0%、4.0%、5.0% 、6.0%對芽孢量具有顯著影響，而添加量為2.0% 時，對芽孢桿菌LYC-1芽孢量沒有顯著影響。

圖3 豆粕粉添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響

2.4 米糠不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

如圖4所示，芽孢桿菌LYC-1芽孢量從米糠添加量0.0%到4.0%之間，隨著添加量增加，芽孢量呈平緩的增加趨勢，在4.0%時達(dá)到最大值，為(6.76±0.47)×109CFU/g，添加量超過4.0%時，芽孢量呈陡然下降趨勢；與對照組相比較，米糠的添加量4.0%時對芽孢桿菌LYC-1芽孢量具有顯著影響，而米糠添加量為2.0%、3.0%、5.0%、6.0% 時，對芽孢桿菌LYC-1芽孢量沒有顯著影響。

圖4 米糠添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響

2.5 磷酸二氫鉀不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

不同種類的微生物對無機(jī)鹽的需求具有差異性，而微生物合成某種代謝產(chǎn)物對無機(jī)鹽的選擇也迥然不同[14-15]。如圖5所示，芽孢桿菌LYC-1芽孢量從KH2PO4添加量 0.00%到0.25%之間，隨著KH2PO4添加量增加，芽孢量呈增加趨勢，在 0.25%時達(dá)到最大值，為（6.76±0.47）×109CFU/g，KH2PO4添加量超過0.25%時，芽孢量呈下降趨勢；與對照組相比較，KH2PO4的添加量0.25%，對芽孢桿菌LYC-1芽孢量具有顯著影響，而KH2PO4的添加量為0.2%、0.3%、0.35%、0.4%時，對芽孢桿菌LYC-1芽孢量沒有顯著影響。

圖5 磷酸二氫鉀添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響

2.6 碳酸鈣不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響

如圖6所示，芽孢桿菌LYC-1芽孢量從CaCO3添加量0.00%到 0.20%之間隨著碳酸鈣添加量增加，芽孢量呈平緩增加的趨勢，在0.2%時達(dá)到最大值，為(6.16±0.47)×109CFU/g，碳酸鈣添加量超過0.2%時，芽孢量呈緩慢的下降趨勢；與對照組相比較，CaCO3不同的添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量都沒有顯著影響。

圖6 碳酸鈣添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響

3 討論

菌糠經(jīng)過了食用菌的利用而被吸收了大部分的營養(yǎng)物質(zhì)，但作為生物質(zhì)廢物而言，其中所含有的有機(jī)物質(zhì)、氮素以及各類微量元素等還是相當(dāng)豐富的[13]，經(jīng)過芽孢桿菌LYC-1的發(fā)酵生產(chǎn)的動物微生態(tài)制劑，成本低，實現(xiàn)了高值化利用，減少了菌糠廢棄物對環(huán)境造成的污染。從圖1中柱形圖進(jìn)行比較，可看出猴頭菇菌糠不宜替代粗麩皮作為該菌的培養(yǎng)基原料，這可能由于猴頭菇菌糠中的菌絲體含有猴頭菌素Fr-3-1，它對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，腸源芽孢桿菌LYC-1也是革蘭氏陽性菌，有可能受到猴頭菌素的抑制，這在后續(xù)的實驗中進(jìn)一步論證。杏鮑菇菌糠、金針菇菌糠及其它們的組合都適宜替代麩皮固體培養(yǎng)基中占80%以上的麩皮作為主要原料來生產(chǎn)微生態(tài)制劑。杏鮑菇生長周期短、生物轉(zhuǎn)化率低，培養(yǎng)料中的營養(yǎng)成分未被充分分解利用[14]，而且其菌糠含有豐富的菌體蛋白。金針菇菌糠蛋白質(zhì)中總氨基酸含量為55.29%，氨基酸種類齊全，必需氨基酸占總氨基酸量的37.62%，相對于雞蛋蛋白(標(biāo)準(zhǔn)蛋白)的貼近度為0.7741[15]，非常適合作為麩皮的替代原料生產(chǎn)益生菌。

不同的發(fā)酵基質(zhì)對芽孢桿菌LYC-1芽孢量的影響差異不同。本實驗以金針菇菌糠培養(yǎng)基為對照組，分別添加不同比例的玉米粉、豆粕粉、米糠和磷酸二氫鉀、碳酸鈣等發(fā)酵基質(zhì)作為實驗組，研究這幾種基質(zhì)對芽孢桿菌LYC-1芽孢量影響的差異性。結(jié)果表明，玉米粉對芽孢量的增長有顯著影響，適宜作為芽孢桿菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵基質(zhì)，這是由于玉米粉富含B族維生素和淀粉，為芽孢桿菌LYC-1提供了碳源和生長因子；豆粕粉可以為芽孢菌生長提供一定的碳源、氮源以及生長因子，其粗蛋白質(zhì)含量很高，達(dá)到45%以上，是生產(chǎn)中最常用的氮源原料之一，對芽孢量的提高有很大影響；4.0%米糠的添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量具有顯著影響，這由于米糠含有豐富的B族維生素、脂肪酸和礦質(zhì)元素，給微生物提供碳源及維生素等豐富的生長因子，影響著菌體的生長，但米糠不宜添加過多，因為米糠中含有糠醛，對微生物生長有負(fù)面影響，且米糠中含有較多的脂肪酸，微生物通過脂肪酸的β-氧化，需要消耗較多能量，降低碳源的利用效率。無機(jī)鹽磷和鈣不僅為微生物提供生長代謝所需的離子，同時保持細(xì)胞內(nèi)滲透壓和pH的穩(wěn)定，維持機(jī)體正常生命活動，同時，Ca2+還能提高水解酶的活性；磷酸二氫鉀的添加量0.25%，對芽孢桿菌LYC-1芽孢量增加具有顯著影響，而CaCO3添加量對芽孢桿菌LYC-1芽孢量都沒有顯著影響，但CaCO3添加對調(diào)節(jié)物料的pH有一定作用。分析其原因是金針菇栽培配方中含有1.5%的輕質(zhì)CaCO3，故在其菌糠中殘留未利用的CaCO3，足夠提供發(fā)酵中Ca2+的需求。

綜上所述，金針菇菌糠和杏鮑菇菌糠可以完全替代麩皮，添加5.0%豆粕、5.0%玉米粉、4.0%米糠、0.25%磷酸二氫鉀都對提高芽孢量有顯著影響，這為高值化利用食用菌菌糠和選擇合適的發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)動物微生物添加劑提供了參考。