劉鳳銀， 盧嘉輝， 巫嘉琦， 黃燕璇， 鄒紅麗， 梁岳， 穆洪濤

(廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 廣東 廣州 510303)

*通信作者：穆洪濤，男，山東德州人，廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院講師，博士.

0 引言

酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是將抗原抗體結(jié)合的高度特異性及酶的高效催化性相結(jié)合的一種免疫分析方法，具有靈敏度高、快速簡便、成本低廉等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、藥物分析、動物檢疫、病蟲害防治等領(lǐng)域[1-3]. ELISA測定中，最后一步的酶催化顯色反應(yīng)起到信號放大作用，通過測定顏色的深淺來計算待測物的含量. 因此，底物顯色液的質(zhì)量及顯色系統(tǒng)的穩(wěn)定性直接決定了試驗的成敗[4-6]. 目前，雖已有商品化的顯色液產(chǎn)品，但由于涉及商業(yè)機密，其配方極少公開，同時存在產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、價格昂貴等問題，當(dāng)教學(xué)或科研中需使用大量顯色液時，將大大增加實驗的成本和不穩(wěn)定性因素[7].

本研究以農(nóng)藥氟樂靈間接ELISA顯色系統(tǒng)為例，通過單因素試驗，初步探討各因素對辣根過氧化物酶/3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(HRP/TMB)顯色體系的影響，通過正交試驗確定最佳工作條件，并對顯色液的儲藏穩(wěn)定性進行研究，以期提供一種HRP/TMB顯色體系的優(yōu)化方法及一種靈敏度高、性能穩(wěn)定的顯色液配方，為相關(guān)領(lǐng)域工作者提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料與試劑

鼠源抗氟樂靈單克隆抗體、氟樂靈包被原(實驗室自制)；牛血清白蛋白(BSA)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(HRP-IgG)(美國sigma公司)；TMB、過氧化脲、吐溫-20、二甲基亞砜(DMSO)、甘油、蔗糖(上海阿拉丁試劑公司)；96孔酶標(biāo)板(廈門怡佳美實驗器材有限公司). 其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為一級水.

ELISA測定中所用緩沖液. 磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)；碳酸鹽緩沖液(CB，0.05 mol/L，pH 9.6)；洗滌緩沖液(PBST，0.01 mol/L，pH 7.4，PBS-0.5 mol/L,吐溫-20)；封閉液(0.01 mol/L，pH 7.4，PBS-1% BSA，10%蔗糖，現(xiàn)配現(xiàn)用)；終止液(10% H2SO4).

1.1.2 實驗儀器

SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)；Wellwashi MK2洗板機(美國Thermo公司)；PHSJ-4F pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；JA2603B(M)分析天平(0.1 mg)(上海精科科學(xué)儀器有限公司)；微量移液器(德國艾本德股份公司)；DK-8D電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；DHG-9140AD 鼓風(fēng)干燥箱(上海東麓儀器設(shè)備有限公司)；NC-B型超純水設(shè)備(重慶尼珂).

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA的操作步驟

包被：將氟樂靈包被原用CB稀釋成1 μg/mL進行包板，100 μL/孔，37 ℃水浴箱中孵育過夜；洗滌：傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗板2次. 封閉：加封閉液120 μL/孔，37 ℃孵育3 h，甩干孔內(nèi)液體，倒置于37 ℃烘箱中，烘干1 h備用. 加樣及孵育：將抗氟樂靈單克隆抗體用PBST稀釋至合適濃度，100 μL/孔，37 ℃孵育40 min，洗板5次. 加酶標(biāo)二抗：將HRP-IgG用PBST稀釋5 000倍，100 μL/孔，37 ℃孵育40 min，洗板5次. 顯色：加顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育后，每孔加50 μL終止液，終止反應(yīng). 測定：采用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光值A(chǔ)450 nm.

1.2.2 顯色液的配制

顯色液采用雙組分形式. 將0.2 mol/L乙酸鈉、0.1 mol/L檸檬酸按不同體積比混合，配置成不同pH的緩沖液，加入過氧化脲得組分1；精確稱取TMB溶于DMSO中，并加入一定體積的甘油，配置成儲備液，用含有EDTA-Na20.1 g、一水合檸檬酸0.42 g的溶液稀釋到合適濃度得組分2. 使用時，將組分1、組分2等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2.3 單因素試驗

進行ELISA實驗，測定各孔A450 nm值. 考察pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、TMB質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L)、過氧化脲質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 g/L)、DMSO體積分數(shù)(0.5%、1%、2%、4%、8%、16%)、甘油體積分數(shù)(0、0.5%、1.0%、2%、4%、8%)、顯色時間(5、10、15、20、25、30、35、40 min)對顯色效果的影響. 通過調(diào)整氟樂靈單克隆抗體的濃度，使最大吸光值在1.0～1.5之間. 同時做空白對照試驗，考察顯色液的自發(fā)顯色.

1.2.4 正交試驗

以緩沖液pH、TMB質(zhì)量濃度、過氧化脲質(zhì)量濃度、顯色時間為考察因素，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取單因素峰值和前后臨近兩點共計3個水平，進行4因素3水平正交試驗. 具體正交試驗因素水平設(shè)置見表1.

表1 正交試驗因素水平

1.2.5 穩(wěn)定性試驗

配制顯色液組分1、組分2，4 ℃密封避光儲存. 每隔10 d取出與當(dāng)天新配制組分1、組分2同時用于ELISA試驗，分別測定其對應(yīng)的吸光值，前者記為A，后者記為A0. 以儲存時間為橫坐標(biāo)、比吸光值A(chǔ)/A0為縱坐標(biāo)，繪制曲線，確定本配方顯色液的儲存穩(wěn)定性及使用有效期.

1.2.6 自制顯色液與市售同類產(chǎn)品對比分析

按照最佳工作條件，配制HRP/TMB雙組分顯色液. 在氟樂靈ELISA檢測體系中，分別采用自制的和三種市售的雙組份顯色液，進行試驗，顯色0、3、6、9、12、15、18 min后測定A450 nm. 以顯色時間為橫坐標(biāo)、A450 nm為縱坐標(biāo)，繪制曲線，比較不同顯色液的靈敏度、顯色時間、本底值及穩(wěn)定性等性能參數(shù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗做3個平行試驗. 實驗數(shù)據(jù)采用excel計算數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差；采用spss 19.0進行正交試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)方差分析；采用origin 8.5對數(shù)據(jù)進行擬合分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

a～j字母不同表示差異顯著(p<0.05)圖1 pH對顯色效果的影響

2.1.1 pH對顯色效果的影響

HRP/TMB顯色體系中，pH主要通過改變酶和底物的解離狀態(tài)，影響酶與底物的結(jié)合能力以及酶的催化能力，進而影響顯色效果[8-9]. 根據(jù)采用的供氫體的不同，pH對顯色效果的影響亦不同. 通過調(diào)整緩沖液兩組分的體積比，使顯色液的最終pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，考察以TMB作為供氫體時， pH對顯色效果的影響. 結(jié)果見圖1. 可以看出，顯色液的pH對顯色效果有顯著影響. 當(dāng)pH為4.5～5.5時顯色效果最佳，當(dāng)pH大于5.5或小于4.5時，A450 nm顯著降低.

2.1.2 TMB質(zhì)量濃度對顯色效果的影響

可作為HRP供氫體的有鄰苯二胺(OPD)、2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和TMB，前兩者由于具有潛在的致癌性而逐漸被TMB所替代[10]. 本研究中，采用TMB作為供氫體. 由圖2所示，隨著TMB質(zhì)量濃度的提高，吸光值先增大后降低；TMB質(zhì)量濃度為0.2 g/L時，吸光值最大，0.4 g/L時吸光值稍降，但兩者無顯著差異；0.8 g/L時吸光值顯著下降，可能原因是組分1、組分2混合后，pH升高，TMB溶解度下降，其在溶液中的分散度下降；配置TMB質(zhì)量濃度為1.6 g/L顯色液時，TMB過飽和析出.

2.1.3 過氧化脲質(zhì)量濃度對顯色效果的影響

HRP對受氫體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物，其中過氧化脲的穩(wěn)定性遠高于前兩者[5,11]. 為了獲得穩(wěn)定性更高的顯色液，保證實驗的重復(fù)性，本研究采用過氧化脲作為受氫體. 由圖3所示，隨著過氧化脲質(zhì)量濃度的提高，吸光值先增大后逐漸降低，0.2 g/L時達到最大. 可能原因是HRP以鐵卟啉為輔基，分子中含有一個Fe2+，高質(zhì)量濃度過氧化脲致部分Fe2+氧化為Fe3+，導(dǎo)致酶失活；同時，高質(zhì)量濃度過氧化脲有一定的漂白作用，導(dǎo)致吸光值降低.

2.1.4 DMSO體積分數(shù)對顯色效果的影響

在顯色劑的配置中，TMB的溶解度是一關(guān)鍵因素，直接影響到檢測的敏感性[10]. TMB為脂溶性，性質(zhì)穩(wěn)定，但溶解度較低，其中在DMSO中的溶解度最大(20 mg/mL)，因此本研究采用DMSO作為TMB的溶劑. DMSO體積分數(shù)過低，TMB的分散效果不佳，但有機溶劑體積分數(shù)過高會降低酶活性，影響顯色效果. 由圖4所示，當(dāng)DMSO體積分數(shù)控制在8%之內(nèi)時，吸光值變化不大，超過16%時，吸光值下降明顯；DMSO體積分數(shù)為2%時，吸光值達到最大，因此本研究選取2%作為最佳DMSO體積分數(shù). 此體積分數(shù)下，TMB的溶解度良好.

2.1.5 甘油體積分數(shù)對顯色效果的影響

TMB對溫度敏感，儲備液需4 ℃存放，但由于DMSO在4 ℃呈固態(tài)，導(dǎo)致取用不便. 本研究嘗試加入一定體積分數(shù)的甘油，使儲備液保持液體狀態(tài). 故考察了不同體積分數(shù)甘油對顯色效果的影響，見圖5. 可以看出，適當(dāng)加入一定體積分數(shù)的甘油，吸光值增大，有助于顯色反應(yīng)的進行；但甘油體積分數(shù)過高，吸光值緩慢降低，抑制顯色反應(yīng)的進行. 本著靈敏、節(jié)約原則，選取儲備液可保持穩(wěn)定液態(tài)時甘油的加入量，即0.5%.

2.1.6 顯色時間對顯色效果的影響

酶促反應(yīng)為一可逆過程. 隨著反應(yīng)的進行，底物TMB質(zhì)量濃度越來越低，產(chǎn)物濃度越來越高，酶促反應(yīng)速率逐漸降低. 由圖6所示，當(dāng)顯色反應(yīng)進行15 min時，底物TMB已基本消耗完畢，吸光值最大；隨著顯色時間的延長，吸光值基本保持不變.

2.2 正交實驗

影響HRP/TMB顯色的因素很多，本研究根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取了對顯色影響較大的四個因素：pH、TMB質(zhì)量濃度、過氧化脲質(zhì)量濃度和顯色時間，進行L9(34)正交試驗，考察各因素之間的交互作用. 結(jié)果見表2. 由極差分析結(jié)果可知，對顯色效果影響的主次順序為 TMB質(zhì)量濃度>過氧化脲質(zhì)量濃度>pH>顯色時間. HRP/TMB顯色體系的最佳反應(yīng)組合條件為A2B3C3D1. 此組合在表2中未出現(xiàn)，正交實驗均值最高組合為A1B3C3D3. 進一步比對兩種組合下的顯色效果，A2B3C3D1組合顯色吸光值為1.501，A1B3C3D3組合顯色吸光值為1.392，兩者有顯著性差異(t=16.700 8，p<0.05)，因此確定最佳顯色條件為A2B3C3D1，即pH為5.0，TMB質(zhì)量濃度為0.4 g/L，過氧化脲質(zhì)量濃度為0.4 g/L，DMSO體積分數(shù)為2%，甘油體積分數(shù)為0.5%，顯色時間為10 min.

2.3 穩(wěn)定性試驗

為提高實驗效率，避免每次使用前都需要現(xiàn)配組分1和組分2，本研究測定了其3個月內(nèi)顯色效果的變化情況. 為防止不同批次包被、一抗?jié)舛群兔笜?biāo)抗體稀釋度對吸光值的影響，本研究采用比吸光值代替吸光值，以提高數(shù)據(jù)的可信性. 結(jié)果見圖7. 可見，90 d后，顯色液的顯色效果呈緩慢下降趨勢；110 d后下降趨勢明顯. 120 d內(nèi)，本底值穩(wěn)定在0.1以下，顯色液自發(fā)顯色不明顯. 因此，顯色液組分1和組分2，需分別存放在4 ℃冰箱中，3個月內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.4 自制顯色液與市售同類產(chǎn)品對比分析

為考察本研究制備出的HRP/TMB雙組分顯色液的質(zhì)量，本研究選購了3種市售的代表性雙組分顯色液產(chǎn)品，與本實驗自制顯色液，同時進行ELISA實驗，從靈敏度、顯色時間、本底值及穩(wěn)定性幾個方面進行對比分析. 具體結(jié)果見圖8. 從圖中可知，與市售顯色液1相比，自制顯色液靈敏度較高，顯色反應(yīng)較迅速，時間較短；與市售顯色液2相比，自制顯色液靈敏度與其相當(dāng)，但比其顯色時間短；與市售顯色液3相比，自制顯色液靈敏度略低，兩者均反應(yīng)較迅速，在12 min左右，達到了顯色平臺期. 四種顯色液的本底值都比較低，其中市售顯色液3的本底值略高，但均保持在0.2以下，在顯色時間內(nèi)，不影響結(jié)果. 作為商品化產(chǎn)品，3種市售顯色液的有效期均在18個月以上，穩(wěn)定性遠優(yōu)于本實驗自制的顯色液.

表2 正交試驗結(jié)果

實驗序號影響因素pHTMB 質(zhì)量濃度/(g/L)過氧化脲質(zhì)量濃度/(g/L)顯色時間/minA450nm111110.732212221.110313331.405421230.859522311.296623121.202731320.745832130.907933211.169k11.0820.7790.9471.066k21.1191.1041.0461.019k30.9401.2591.1491.057R0.1790.4800.2020.047

注：k1、k2、k3為各因素同一水平下A450nm的平均值；R為各因素k1、k2、k3的極差.

3 結(jié)論與討論

HRP/TMB顯色過程是ELISA試驗成敗的關(guān)鍵因素. 本研究通過單因素試驗探討了pH、TMB質(zhì)量濃度、過氧化脲質(zhì)量濃度、DMSO體積分數(shù)、甘油體積分數(shù)和顯色時間對顯色效果的影響，并通過L9(34)正交實驗確定了影響顯色效果的主次順序為TMB質(zhì)量濃度>過氧化脲質(zhì)量濃度>pH>顯色時間，確定了HRP/TMB顯色體系最佳工作條件為pH為5.0，TMB質(zhì)量濃度為0.4 g/L，過氧化脲質(zhì)量濃度為0.4 g/L，DMSO體積分數(shù)為2%，甘油體積分數(shù)為0.5%，顯色時間為10 min. 在不添加保護劑的情況下，4 ℃儲藏，可穩(wěn)定3個月左右.

與3種市售同類產(chǎn)品對比，自制的顯色液在靈敏度、顯色時間方面均較好，但穩(wěn)定性要遠低于商品化的產(chǎn)品. 目前，本實驗研制的HRP/TMB雙組分顯色液能夠滿足絕大多數(shù)的實驗室ELISA研究，但尚不能滿足商品化銷售對保質(zhì)期的要求. 后續(xù)，可嘗試通過添加聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通X-405等穩(wěn)定劑，進一步延長顯色液保質(zhì)期，擴大其應(yīng)用范圍[12-13].