劉 義，楊 浩，吳 迪，李 驊，趙智君

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；2.重慶渝北區(qū)人民醫(yī)院骨科，重慶 401120）

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血供，基質(zhì)中軟骨細胞稀疏，缺乏分裂增生能力，其自身修復(fù)能力有限，關(guān)節(jié)軟骨損傷通常會引發(fā)嚴重的關(guān)節(jié)軟骨退變。在關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療中，臨床采用的技術(shù)包括骨髓刺激術(shù)（軟骨下骨鉆孔、微骨折等）、同種骨軟骨移植、馬賽克軟骨移植及基于自體軟骨細胞移植的ACI和MACI。骨髓刺激術(shù)通常在局部形成纖維軟骨，而結(jié)合ACI或者MACI，可以形成透明軟骨樣組織，具有較好的遠期效果[1]。MACI基于組織工程技術(shù)，將體外擴增的自體軟骨細胞種植于支架材料中進行移植，其關(guān)鍵技術(shù)在于軟骨細胞的分離培養(yǎng)及制備理想的支架材料。

1 材 料

1.1 實驗動物

取昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的6只成年新西蘭大白兔，周領(lǐng)34～37周，體重1.8～2.2 kg。

1.2 主要試劑和儀器（見表1）

表1 主要儀器和試劑

2 方 法

2.1 軟骨細胞獲取

取6只成年新西蘭大耳白兔（昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體重1.8～2 kg，空氣栓塞處死，切取股骨內(nèi)、外側(cè)髁軟骨，置入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。

生理鹽水沖洗軟骨塊三遍，使用手術(shù)刀片將其切為0.5 mm3大小的碎粒，用吸管移入離心管中1000 rpm離心10 min，去上清液，加入十倍左右的0.1﹪Ⅱ型膠原酶置入培養(yǎng)箱消化8小時，可見軟骨顆粒大部分消化，取出后，放入恒溫搖床中，37℃ 120 r/min消化1小時，可見軟骨顆粒完全消化。l000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用30倍的PBS平衡液清洗、離心3遍后，在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中加入，其含谷氨酰胺292 mg/L+維生素C 50 mg/L+10%胎牛血清+1%雙抗液，混勻后，轉(zhuǎn)移至25 ml普通培養(yǎng)瓶中，在37℃、5﹪CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

2.2 細胞培養(yǎng)的觀察與傳代

（1）軟骨細胞的活性檢測及傳代培養(yǎng)：將10 g/L的臺盼盤藍液與原代細胞懸液以1：9的比例滴入離心管中，混勻后放置2～3 min，取一滴均勻分散于計數(shù)板，計算活細胞數(shù)。

（2）倒置顯微鏡下觀察原代細胞貼壁時間，各代細胞的形態(tài)和生長狀況差異等。

（3）傳代培養(yǎng)：軟骨細胞融合達80～90%時，使用0.125%的胰蛋白酶消化，以1：2的比例傳代。

2.3 軟骨細胞的鑒定

2.3.1 細胞爬片

將第二代軟骨細胞制成1×106/ml濃度，滴加至蓋玻片（硅化處理）上，置于培養(yǎng)箱中，6小時后，細胞完成貼壁，再向培養(yǎng)板中加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中。24小時后取出蓋玻片，用PBS液洗兩次后4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，吸水紙吸干殘留液體，中性樹膠粘貼于載玻片上等待染色。

2.3.2 Mallory特染

將1%Triton-x-100滴加至爬片，室溫下作用30分鐘，PBS液洗三次，共5分鐘。蘇木素染色2～3分鐘。蒸餾水洗，0.5%鹽酸乙醇分化。蒸餾水洗，至返藍為止。蒸餾水洗，滴加酸性復(fù)紅水溶液，作用5分鐘。不經(jīng)水洗，直接滴加Mal1ory苯胺藍-橘黃G溶液，作用10分鐘。過95%乙醇及無水乙醇分化兼脫水。中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.3.3 甲苯胺藍染色

PBS液漂洗細胞爬片2次，95%酒精固定15分鐘，PBS液漂洗3次，每次1分鐘。滴加1%甲苯胺藍染液。蒸餾水洗。經(jīng)70%、80%、90%酒精各1次，95%酒精2次和100%酒精3次逐級脫水，每次1分鐘。二甲苯透明3次，每次1分鐘。中性樹膠封片，鏡下觀察。

2.3.4 II型膠原免疫組化染色

滴加1% Triton-x-100至細胞爬片，室溫下作用30分鐘，予PBS液洗三次，共5分鐘。滴加3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，PBS液沖洗3次，3分鐘/次。吸去PBS，滴加Ⅱ型膠原單克隆抗體，濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜。PBS液沖洗3次，5分鐘/次，吸去PBS后滴加聚合物增強劑，室溫下孵育20分鐘，PBS沖洗3次，3分鐘/次。吸去PBS，滴加酶標抗羊/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘，PBS沖洗3次，3分鐘/次。吸去PBS，滴加DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5分鐘，顯色效果滿意時終止染色。自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，梯度酒精逐級脫水干燥，中性樹膠封固，鏡下觀察。

2.4 組織工程軟骨檢測

2.4.1 藻酸鈉凝膠的制備

分析純低粘度藻酸鈉溶于含有0.15 mol/l的NaCl的溶液中，使藻酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為1.2℅，磁力攪拌機攪拌，pH值調(diào)為7.4。0.22 μm濾網(wǎng)過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 種子細胞的準備

第二代軟骨細胞消化后，吹打制成細胞懸液，細胞計數(shù)后將細胞懸液置入50 ml尖底離心管，待全部細胞收集完后，1000 r/min×10 min離心，去上清后等待接種。

2.4.3 藻酸鈣-軟骨細胞凝珠及空白藻酸鈣凝珠的制備

第二代軟骨細胞消化后，1000 rpm離心10 min，去上清液后進行細胞計數(shù)。用1.2%藻酸鈉溶液調(diào)至細胞密度為5×106/ml，吸入10 ml注射器中，以較慢的速度在40 ml CaCl2溶液中滴入該混合溶液，CaCl2溶液濃度為102 mMol/l，第一時間交聯(lián)促進凝珠的形成，室溫下進行12 min反應(yīng)，從而將最佳的交聯(lián)效果獲取過來。將CaCl2溶液吸出來，用0.15 mol/l NaCl溶液反復(fù)沖洗4次，高糖DMEM完全培養(yǎng)液沖洗1次。將凝珠移入6孔培養(yǎng)板中，每孔植入8～10枚凝珠為宜，加入高糖DMEM完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每三天換液一次，共4周（圖1）。以同樣方法制備不含軟骨細胞的空白藻酸鈣凝珠。

2.4.4 細胞－載體復(fù)合物及空白載體倒置相差顯微鏡下觀察、冰凍切片HE染色、II型膠原免疫組化染色

在細胞培養(yǎng)無菌操作實驗臺中，從6孔培養(yǎng)板中取出2枚藻酸鈣-軟骨細胞凝珠于無菌25ml培養(yǎng)瓶中，置于倒置相差顯微鏡下觀察藻酸鈣-軟骨細胞凝珠內(nèi)部成分。將培養(yǎng)4周的藻酸鈣-軟骨細胞凝珠隨機取出，行冰凍切片HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色。

2.4.5 II型膠原mRNA RT-PCR檢測

取單層培養(yǎng)的第二代軟骨細胞和支架內(nèi)培養(yǎng)至1、4周的軟骨細胞進行II型膠原mRNA RT-PCR檢測，空白藻酸鈣支架作為對照。使用Primer Express 3.0軟件（美國ABI公司）設(shè)計家兔Ⅱ型膠原基因引物，由上海生工合成，從NCBI GeneBank尋找家兔Ⅱ型膠原基因的mRNA序列，基因編號D83228.1。引物序列：上游、下游分別為5’-CCA AGA AGA ACT GGT GGA GC-3’、5’-TAG GTG ATG TTC TGG GAG CC-3’。長度、退火溫度分別為178 bp、60℃，根據(jù)Trizol說明書提取RNA，PCR條件為在95℃、94℃、61℃、72℃的溫度下分別進行10 min的預(yù)變性、15 s的變性、20 s的退火、50 s的延伸，35個循環(huán)，最后在72℃的溫度下進行2 min的延伸。用2%凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

3 結(jié) 果

（1）原代細胞接種后24小時開始貼壁，之后逐漸有細胞從團塊中爬出貼壁，為三角形或多角型，7～10天后融合達80～90%，成鋪路卵石狀。傳代細胞貼壁加快，約接種后2小時開始貼壁，12小時完成貼壁，3天融合達80～90%，傳代至第四代后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，有較多偽足伸出，細胞生長減慢。

（2）臺盼藍拒染測得活性率為95.8﹪。

第三代軟骨細胞爬片甲苯胺藍染色圖×100

（3）軟骨細胞爬片甲苯胺藍染色，可見胞質(zhì)中有紫紅色異染顆粒。

（4）Mallory染色可見軟骨細胞胞漿呈深藍色。

第三代軟骨細胞Mallory染色呈陽性×100圖

（5）軟骨細胞爬片II型膠原染色見胞漿呈棕黃色，細胞核藍染。

第三挖潛軟骨細胞II型膠原免疫組化染色陽性×100圖

（6）空白藻酸鈣凝珠載體呈水滴狀，白色半透明，有一定的強度和韌性。直徑約為3 mm。冰凍切片經(jīng)HE染色，可見藍染纖維狀結(jié)構(gòu)交織成網(wǎng)狀，網(wǎng)眼較均勻一致。

藻酸鈣凝珠外觀，直徑約3mm；空白藻酸鈣凝珠冰凍切片HE染色×100

（7）藻酸鈣復(fù)合軟骨細胞懸液制成藻酸鈣-軟骨細胞凝珠后，直徑約3 mm，倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)凝珠內(nèi)部軟骨細胞呈圓形，單個散在分布。培養(yǎng)4周后，倒置相差顯微鏡下可見大量軟骨細胞單個或團狀散在分布在藻酸鈣載體中，單個細胞呈圓形且透亮，細胞澤光性好，分布密集、均勻，培養(yǎng)4周后材料內(nèi)部軟骨細胞數(shù)目明顯較培養(yǎng)前多。HE染色可見載體材料被染成淡藍色，藍染的軟骨細胞位于材料的網(wǎng)狀空隙中，數(shù)目較多。培養(yǎng)4周后的藻酸鈣-軟骨細胞凝珠Ⅱ型膠原免疫組化染色，可觀察到載體中軟骨細胞胞漿及載體材料內(nèi)部均被染成棕黃色，細胞核染為淡藍色。

倒置相差顯微鏡下觀察×100；4周后倒置相差顯微鏡下觀察×100；冰凍切片HE染色×100；II型膠原免疫組化染色×100

（8）第二代單層培養(yǎng)的軟骨細胞和復(fù)合藻酸鈣后培養(yǎng)至1、4周的軟骨細胞，經(jīng)凝膠電泳鑒定，II型膠原mRNA RT-PCR產(chǎn)物均在178bp處出現(xiàn)陽性條帶，空白支架處未出現(xiàn)條帶。

4 討 論

在本實驗中，軟骨細胞在復(fù)合海藻酸鈉水凝膠材料后第一時間將其原形恢復(fù)過來，終呈橢圓形或圓形。HE染色可見藍染的軟骨細胞散在分布于類似軟骨陷窩的網(wǎng)狀晶格中。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)顯示細胞具有旺盛的Ⅱ型膠原分泌，說明海藻酸鈉載體培養(yǎng)極好地維持了軟骨細胞表型。在軟骨細胞的培養(yǎng)中，將海藻酸鈉充分利用起來一方面不會引發(fā)去分化現(xiàn)象，另一方面還能夠?qū)毎那蛐涡螒B(tài)進行長期維持，而在軟骨細胞表型的穩(wěn)定中，維持球形結(jié)構(gòu)具有極為重要的作用。本實驗也表明，海藻酸鈉中軟骨細胞呈球形，生長呈叢狀，免疫學(xué)、組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)有Ⅱ型膠原、蛋白聚糖出現(xiàn)在細胞周圍，其為軟骨細胞所特有，分泌主體為軟骨細胞，隨著時間的延長逐漸增多，軟骨細胞海藻酸鈉凝膠強度也隨著這些軟骨基質(zhì)數(shù)量的增加而提升。從這里我們可以看出，經(jīng)體外培養(yǎng)的功能正常的海藻酸鈉復(fù)合兔軟骨細胞進行體外短期培養(yǎng)，軟骨細胞支架復(fù)合物形成后進一步體內(nèi)實驗的條件具備。

5 結(jié) 論

酶消化結(jié)合振蕩培養(yǎng)消化法具有較高的軟骨組織消化率，實驗構(gòu)建的組織工程軟骨具有軟骨組織的特征。