何克林 ，胡蓉 ，馬睿杰 ，

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，杭州 310000;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053)

脊髓損傷是一種破壞性極大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由于脊髓結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致神經(jīng)沖動(dòng)無法向下傳遞，從而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。近年來，隨著社會(huì)的快速發(fā)展，外傷性脊髓損傷的發(fā)病率有不斷上升的趨勢(shì)[1]。脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)障礙，使患者癱瘓?jiān)诖?，無法活動(dòng)，給患者和家庭帶來極大的壓力。在臨床上，電針對(duì)脊髓損傷具有較好療效[2]，減重步行訓(xùn)練(body weight support treadmill training， BWSTT)是通過減輕脊髓損傷的下肢負(fù)重，以便更早地參與功能鍛煉的一種康復(fù)運(yùn)動(dòng)療法[3]。本研究通過制備外傷性脊髓損傷大鼠模型，探討電針聯(lián)合 BWSTT對(duì)磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain， p-MLC)和中樞髓鞘來源的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制受體(Nogo-66 receptor，NGR)表達(dá)及髓鞘超微結(jié)構(gòu)的影響以及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買[動(dòng)物合格證書 SCXK(滬)2013-0016]。將 60只 SD成年雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，編號(hào)1～60并導(dǎo)入SPSS軟件進(jìn)行隨機(jī)分組，分為正常組、模型組、電針(EA)組、藥物組和 EA＋運(yùn)動(dòng)組，每組 12只，每組有連續(xù)治療7 d和14 d的2個(gè)亞組，每個(gè)亞組均有6只SD大鼠。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

NYU脊椎沖擊損傷儀(美國(guó)健康醫(yī)療儀器國(guó)際公司型號(hào)NYU-2);冰凍切片機(jī)(microm HM550， Thermo);恒溫水箱(DK-600S型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Mini-PROTEAN垂直電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad);華佗牌針灸針(0.18 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);HANS穴位神經(jīng)刺激儀(HANS100A，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);蛋白紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf);凝膠成像系統(tǒng)(Image Quant LAS4000型，德國(guó) GE 公司);p-MLC(ab2480，美國(guó) Abcam);NGR(ab174323，美國(guó) Abcam);β-actin(ab179467，美國(guó)Abcam);BCA蛋白定量試劑盒(P0018，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 模型制備

所有SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常組僅手術(shù)切除椎板，不造成脊髓損傷，其余 4組均采取改良的Allen法制備脊髓損傷模型[4]。具體方法如下，將大鼠麻醉后俯臥位放置在恒溫動(dòng)物臺(tái)上，先將SD大鼠四肢固定，再用手術(shù)切除大鼠脊柱 T10節(jié)段椎板，充分暴露脊髓，然后放置在美國(guó)NYU脊椎沖擊損傷儀上，參數(shù)設(shè)置為5 g×10 cm，通過下落的短桿垂直撞擊脊髓，造成脊髓組織的損傷。術(shù)后用脊髓損傷行為學(xué)評(píng)分(Basso-Beattie-Bresnahan rating scale， BBB 評(píng)分)評(píng)估造模成功與否，BBB評(píng)分在 3分以下的為造模成功。

1.4 治療方法

正常組和模型組僅常規(guī)觀察。

EA組選用華佗牌針灸針，取損傷部位的上下節(jié)段的夾脊穴，針刺深度以針尖觸及椎板為度，以同側(cè)上下夾脊穴為1組，連上韓式電針儀，設(shè)置頻率為2/100 Hz，留針20 min。每日治療1次。

藥物組予腹腔注射法舒地爾(Fasudil)[5]，劑量為10 mg/kg。每日治療1次。

EA＋運(yùn)動(dòng)組采用夾脊穴電針聯(lián)合 BSWTT進(jìn)行干預(yù)。電針取穴、參數(shù)及方法同EA組。BSWTT具體流程是將減重裝置架設(shè)在活動(dòng)平板(T1501)上，再將 SD大鼠放在活動(dòng)平板上，分別用減重裝置上的前部夾子夾住大鼠的項(xiàng)背部皮膚，后部夾子夾住大鼠背部近鼠尾處，提起大鼠但不脫離活動(dòng)平板，以減輕大鼠后肢負(fù)荷，然后啟動(dòng)活動(dòng)平板讓大鼠后肢隨平板轉(zhuǎn)動(dòng)而進(jìn)行步行訓(xùn)練，活動(dòng)平板的速度為8 m/min，每日減重步行訓(xùn)練2次，每次訓(xùn)練時(shí)間為5 min。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 BBB評(píng)分

采用 BBB評(píng)分[6]觀察脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。連續(xù)治療7 d和14 d后，將脊髓損傷大鼠放進(jìn)曠場(chǎng)，先讓大鼠適應(yīng)性的爬行15 min，對(duì)照BBB評(píng)分表，通過觀察脊髓損傷大鼠后肢各關(guān)節(jié)的細(xì)微活動(dòng)、步態(tài)以及精細(xì)運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行評(píng)分，各時(shí)間點(diǎn)重復(fù)評(píng)估3次，每次評(píng)估間隔30 min，取3次BBB評(píng)分的平均值。

1.5.2 Western blot檢測(cè)

運(yùn)用免疫印跡法檢測(cè)p-MLC和NGR的表達(dá)。大鼠麻醉后，手術(shù)分離損傷段脊髓，取脊髓組織稱重后置于緩沖液中，低溫勻漿，離心取上清液，用 Loary法測(cè)定蛋白含量，用于免疫印跡檢測(cè)。將提取的脊髓組織蛋白(50 μg)加2×SDS上樣緩沖液經(jīng)變性10 min，上樣于8% SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳2 h后轉(zhuǎn)膜，將膜與一抗p-MLC(1:1000)、NGR(1:1000)結(jié)合，放入4℃冰箱孵育過夜，然后與二抗(1:5000)結(jié)合，于室溫條件下孵育1 h，顯色壓片后使用Bandscan5.0軟件分析條帶的光密度值，每個(gè)條帶重復(fù)測(cè)量3次。目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)=目的蛋白(光密度值)/內(nèi)參β-actin(光密度值)。

1.5.3 髓鞘染色

用髓鞘染色(luxol fast blue stain， LFB染色)觀察脊髓損傷大鼠的髓鞘結(jié)構(gòu)。各組大鼠取脊髓組織制作冰凍切片，經(jīng)蒸餾水清洗后，放入0.1% LFB溶液，于 60℃密封過夜，再次用蒸餾水、95%乙醇清洗，放入碳酸鋰溶液30 s，70%乙醇30 s。直至顯微鏡下觀察灰、白質(zhì)區(qū)分清晰為止。再用蒸餾水沖洗，甲苯酚紫復(fù)染30～40 s，再次用蒸餾水沖洗，95%乙醇 5 min(鏡檢)，100%乙醇2×5 min，二甲苯2×5 min，中性樹膠封片觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件處理和分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時(shí)，兩兩比較用最小顯著差法(LSD-t)檢驗(yàn);若方差不齊，則采用Dunnett’s檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分

脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯減弱，BBB評(píng)分結(jié)果顯示，治療7 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組BBB評(píng)分與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療 14 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組BBB評(píng)分較前升高，與模型組和EA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠治療后7 d、14 d BBB評(píng)分比較 (±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與EA組比較3)P＜0.05;與藥物組比較4)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 21±0 21±0模型組 12 1.83±1.171) 8.00±0.891)EA組 12 5.83±0.751)2) 12.17±1.321)2)藥物組 12 8.33±1.031)2)3) 14.67±1.211)2)3)EA＋運(yùn)動(dòng)組 12 6.83±1.161)2)4) 14.00±1.091)2)3)

2.2 p-MLC蛋白表達(dá)

脊髓損傷后大鼠 p-MLC表達(dá)明顯增多，治療 7 d后， EA＋運(yùn)動(dòng)組p-MLC表達(dá)與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療14 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組p-MLC表達(dá)較前減少，與模型組和 EA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠治療后7 d、14 d p-MLC表達(dá)比較 (±s)

表2 各組大鼠治療后7 d、14 d p-MLC表達(dá)比較 (±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與EA組比較3)P＜0.05;與藥物組比較4)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 0.17±0.07 0.16±0.08模型組 12 2.01±0.201) 1.69±0.161)EA組 12 1.17±0.141)2) 0.81±0.051)2)藥物組 12 0.84±0.071)2)3) 0.67±0.051)2)3)EA＋運(yùn)動(dòng)組 12 1.02±0.141)2)4) 0.62±0.051)2)3)

圖1 各組大鼠治療后7 d、14 d p-MLC的表達(dá)

2.3 NGR蛋白表達(dá)

脊髓損傷后NGR表達(dá)明顯增多，治療7 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組 NGR表達(dá)與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療14 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組NGR表達(dá)較前減少，與模型組和 EA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠治療后7 d、14 d NGR表達(dá)比較 (±s)

表3 各組大鼠治療后7 d、14 d NGR表達(dá)比較 (±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與 EA組比較3)P＜0.05;與藥物組比較4)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 0.12±0.03 0.13±0.06模型組 12 1.18±0.161) 1.15±0.081)EA組 12 0.94±0.161)2) 0.86±0.091)2)藥物組 12 0.70±0.051)2)3) 0.65±0.071)2)3)EA＋運(yùn)動(dòng)組 12 1.02±0.151)2)4) 0.77±0.071)2)3)4)

圖2 各組大鼠治療后7 d、14 d NGR的表達(dá)

2.4 LFB染色

脊髓損傷后，軸突髓鞘結(jié)構(gòu)遭到破壞，脊髓白質(zhì)纖維紊亂，髓鞘缺失，有髓神經(jīng)纖維較少，髓鞘染色平均IOD值下降明顯。治療7 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組平均IOD值與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，治療14 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組平均IOD值較前升高，與模型組和EA組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠治療后7 d、14 d LFB染色表達(dá)比較(±s)

表4 各組大鼠治療后7 d、14 d LFB染色表達(dá)比較(±s)

注:與正常組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與 EA組比較3)P＜0.05

組別 n 治療7 d后 治療14 d后正常組 12 7226.52±574.42 6915.04±278.82模型組 12 3830.76±458.251) 3923.02±274.931)EA組 12 4824.98±316.371)2) 5030.47±575.331)2)藥物組 12 5341.76±218.091)2)3) 5690.89±451.951)2)3)EA＋運(yùn)動(dòng)組 12 4888.84±237.861)2) 5655.58±313.231)2)3)

圖3 各組大鼠治療后7 d、14 d髓鞘染色(×400)

3 討論

3.1 中醫(yī)學(xué)對(duì)脊髓損傷的認(rèn)識(shí)

脊髓損傷后可見下肢痿弱無力，影響隨意運(yùn)動(dòng)。中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“痿證”范疇，相關(guān)描述最早可見于《靈樞·寒熱病》:“身有所傷……若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰?！奔顾枋嵌矫}循行之處，督脈主人體一身之陽氣，外力撞擊致脊髓結(jié)構(gòu)形變，則督脈受損，瘀血阻絡(luò)，督脈之氣血運(yùn)行不利，則肢體失養(yǎng)，發(fā)為痿證。治療上，需疏通瘀阻之督脈，促進(jìn)督脈氣血運(yùn)行，肢體得以氣血濡養(yǎng)，則痿證向愈。夾脊穴內(nèi)夾督脈，可疏通督脈之氣血，使督脈之氣能上下貫通。

3.2 夾脊電針結(jié)合 BWSTT對(duì)脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能的作用

脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能遭到破壞，導(dǎo)致患者癱瘓?jiān)诖玻L(zhǎng)此以往，會(huì)進(jìn)一步出現(xiàn)一系列并發(fā)癥。夾脊穴位于脊神經(jīng)的后支上，多項(xiàng)研究證實(shí)夾脊穴電針可促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[7-9]。減重步行訓(xùn)練是一種運(yùn)動(dòng)療法，可用于脊髓損傷后下肢功能恢復(fù)[10-12]。由于脊髓損傷后，患肢肌力明顯下降，還不能支撐自身重力，滿足行走需要。減重步行訓(xùn)練通過減輕下肢負(fù)重，可讓患者更早地參與行走。BBB評(píng)分是評(píng)價(jià)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的常用指標(biāo)，廣泛應(yīng)用脊髓損傷后肢體運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)估[13-14]。本實(shí)驗(yàn)研究通過電針結(jié)合BWSTT，BBB評(píng)分結(jié)果顯示，在連續(xù)治療14 d后，EA＋運(yùn)動(dòng)組的BBB評(píng)分優(yōu)于EA組，說明二者聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

3.3 電針結(jié)合BWSTT對(duì)脊髓損傷大鼠MLC磷酸化調(diào)節(jié)

肌球蛋白輕鏈(myosin light chains， MLC)是RhoA/ROCK信號(hào)的下游底物，RhoA/ROCK信號(hào)激活后能對(duì)下游底物 MLC磷酸化，刺激肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的交聯(lián)，進(jìn)而增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白的收縮，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷，神經(jīng)元突起縮回，使軸突的生長(zhǎng)受到抑制[15]。NGR是位于胞膜外的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白，中樞髓鞘來源的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子均需要與NGR結(jié)合，發(fā)揮抑制髓鞘生成的作用[16-17]。Fasudil是ROCK激酶抑制劑，具有競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，與ATP位點(diǎn)結(jié)合，抑制ROCK激酶活性，調(diào)節(jié)MLC和NGR的表達(dá)，促進(jìn)軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，p-MLC、NGR表達(dá)均明顯增多，電針結(jié)合BWSTT組的MLC磷酸化較模型組表達(dá)少，說明電針結(jié)合BWSTT可能通過抑制ROCK活性，進(jìn)而減少M(fèi)LC磷酸化和中樞髓鞘來源的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子受體NGR的表達(dá)。

3.4 電針結(jié)合 BWSTT對(duì)脊髓損傷大鼠髓鞘超微結(jié)構(gòu)的影響

髓鞘結(jié)構(gòu)是神經(jīng)元軸突表面包裹的富含脂類的多層質(zhì)膜，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的傳導(dǎo)速率，維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以及運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知及情感等高級(jí)神經(jīng)功能具有重要作用[21-23]。脊髓損傷后，神經(jīng)元軸突脫髓鞘性改變，神經(jīng)傳導(dǎo)受到影響，運(yùn)動(dòng)功能遭到破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，脊髓白質(zhì)纖維紊亂，髓鞘缺失，有髓神經(jīng)纖維較少，髓鞘染色平均IOD值下降明顯，說明髓鞘參與脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，電針＋運(yùn)動(dòng)組的髓鞘染色平均IOD值較模型組增多，說明電針結(jié)合BWSTT能干預(yù)髓鞘再生，促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。在治療14 d后，電針＋運(yùn)動(dòng)組的髓鞘染色平均 IOD值優(yōu)于 EA組，提示隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，電針結(jié)合 BWSTT更具有優(yōu)勢(shì)。

綜上，電針結(jié)合 BWSTT可能通過抑制脊髓損傷后MLC的磷酸化及中樞髓鞘來源的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制受體NGR的表達(dá)，保護(hù)髓鞘結(jié)構(gòu)，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。