陳天朝，李 沁 ， 姚 超 ， 耿夢(mèng)麗 ， 常倩倩，于蘭蘭，馬彥江

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000； 3.河南醫(yī)藥技師學(xué)院制劑工程系，河南 開封 457000；4.河南省直第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000)

山藥來自薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的干燥根莖，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列上品，具有補(bǔ)脾胃、益肺腎的作用[1]。山藥的炮制有麩制和清炒制。有關(guān)麩炒的研究比較多，也有側(cè)重于清炒炮制中的炒黃、炒焦研究[2-3]。經(jīng)清炒制的山藥在降血糖、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老方面有療效[4]。飲片的炮制好壞直接影響到制備丸劑的優(yōu)劣。在前期的研究中，根據(jù)山藥飲片的最優(yōu)炮制工藝炮制飲片制備丸劑，研究了山藥丸劑內(nèi)主要成分(淀粉)及指標(biāo)成分(薯蕷皂苷、尿囊素)的含量變化，結(jié)果表明，炮制前后飲片的“形”“色”“氣”“味”及物理化學(xué)性質(zhì)均發(fā)生變化，成分含量及物性變化可作為研究炮制的參數(shù)指標(biāo)[5]。本實(shí)驗(yàn)著重研究炮制前后山藥丸劑物性參數(shù)吸水膨脹、相對(duì)密度pH值、過氧化值及主要成分(淀粉)、指標(biāo)成分(薯蕷皂苷、尿囊素)的含量，通過大、小分子研究山藥炒黃、炒焦后物性變化，使傳統(tǒng)的主觀性判斷可以數(shù)據(jù)化表示，為中藥炮制智能化提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 藥品、試劑與儀器

山藥飲片(批號(hào)1710201)購自河南中一醫(yī)藥經(jīng)營有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部王宏賢副主任藥師鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的干燥根莖；山藥炒黃、炒焦品均為山藥飲片自制。薯蕷皂苷,純度≥98%，上海葉源生物科技有限公司提供,批號(hào)P20A8F3449；尿囊素,純度≥98%，中國食品藥品檢定研究所提供，批號(hào)111501-200202；甲醇(批號(hào)20170903)、無水乙醇(批號(hào)20170529)、乙醚(批號(hào)20170415)，均為分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司產(chǎn)品；甲醇，色譜純，Sigma試劑公司產(chǎn)品。Thermo Evolution 201紫外可見光分光光度計(jì)，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；元素型18120純水裝置，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；BSA224S-CW型電子天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；KQ5200B型機(jī)械超聲波清洗儀器，上海合金超聲設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 山藥丸劑制備

表1 山藥丸劑最佳泛制工藝

2.2 山藥丸劑物性參數(shù)的測(cè)定

2.2.1 膨脹度的測(cè)定

按照2015版《中國藥典》四部通則2101膨脹度的測(cè)定方法[8]。

2.2.2 相對(duì)密度的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[9]，精密稱取1.00 g山藥不同炮制品丸劑，測(cè)定山藥丸劑相對(duì)密度。

2.2.3 pH值的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取山藥不同炮制品丸劑 1.00 g，加入100 mL純化水中，室溫下浸泡1 h，濾過，取濾液，測(cè)pH值，平行測(cè)定3次，取平均值。

2.2.4 過氧化值的測(cè)定

稱取山藥不同炮制品丸劑 7.50 g，按照參考文獻(xiàn)[10] 測(cè)定過氧化值。

2.2.5 物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果

見表2。結(jié)果表明，經(jīng)過不同炮制，山藥丸劑相對(duì)密度、pH值、過氧化值均增大。

表2 山藥丸劑物性參數(shù)均值n=3

2.3 主要成分的測(cè)定

山藥丸劑主要成分為淀粉，采用雙波長法[11]檢測(cè)淀粉中支鏈淀粉、直鏈淀粉的含量。

2.3.1 直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用作圖法，可確定直鏈淀粉的測(cè)定波長、參比波長分別為604 nm、468 nm，支鏈淀粉的測(cè)定波長、參比波長分別為537 nm、718 nm。直鏈淀粉、支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=0.004 5X-0.008 7，r2=0.999 2；Y=0.002 8X+0.005 5，r2=0.998 8。結(jié)果表明：直鏈淀粉、支鏈淀粉分別在20～90 mg/L、80～200 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 主要成分測(cè)定結(jié)果

見表3。

表3 直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量測(cè)定結(jié)果n=3

2.4 指標(biāo)成分的測(cè)定

山藥丸劑的指標(biāo)性成分為尿囊素和薯蕷皂苷。采用紫外-可見分光光度法測(cè)定薯蕷皂苷含量，采用高效液相色譜法測(cè)定尿囊素含量。

2.4.1 薯蕷皂苷的測(cè)定

(1)薯蕷皂苷含量測(cè)定

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品14.09 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，精密吸取該溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.140 9 g/L的對(duì)照品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL， 60 ℃水浴加熱，揮干溶劑，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 50 g/L的香草醛冰乙酸溶液 0.2 mL和高氯酸溶液0.8 mL，于60 ℃水浴中反應(yīng) 20 min，至冰水浴中冷卻，取出，加冰乙酸 5 mL，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法[12]，在455 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.004 7，0.009 4，0.014 1，0.018 8，0.023 5，0.028 6 g/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=36.689X-0.015 3(r2=0.999)。

測(cè)定法：取山藥丸劑適量，粉碎，各取約1 g，精密稱定，加體積分?jǐn)?shù) 200 mL/L乙醇 20 mL，超聲處理60 min，濾過，加體積分?jǐn)?shù)200 mL/L乙醇定容于 25 mL容量瓶中，即得供試品溶液。取供試液1 mL，80 ℃水浴揮干，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中的方法，自“加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 g/L的香草醛冰乙酸溶液 0.2 mL和高氯酸溶液0.8 mL”起，依法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中薯蕷皂苷的量，測(cè)定結(jié)果，見表4。

測(cè)定波長的選擇：取山藥薯蕷皂苷對(duì)照品溶液，以甲醇為對(duì)照，在 400～700 nm波長下進(jìn)行掃描，455 nm 處有最大吸收，確定樣品測(cè)定波長為 455 nm。

精密度試驗(yàn)：取山藥丸劑粉末按上述方法制備5份供試品溶液，測(cè)定結(jié)果的RSD值為0.26 %。結(jié)果表明:儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取山藥丸劑粉末，制備1份供試品溶液，每隔2 h測(cè)定一次吸光度值，計(jì)算RSD值為0.38%。結(jié)果表明:供試品溶液穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一山藥丸劑粉末，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定其吸光度并計(jì)算含量，RSD值為1.15%。結(jié)果表明:該法重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)：精密稱取已知含量的山藥丸劑粉末5份，分別加入薯蕷皂苷適量，按照供試品溶液的制備方法制成加樣回收供試品溶液，測(cè)定山藥總皂苷含量，計(jì)算平均回收率和RSD值。結(jié)果：平均回收率為100.12%，RSD值為2.03%。結(jié)果表明:加樣回收方法良好。

2.4.2 尿囊素的測(cè)定

色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm× 250 mm，5 μm )，流動(dòng)相為甲醇-水(1∶99)，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長224 nm，柱溫30 ℃[12]。

對(duì)照品溶液制備：精密稱取尿囊素對(duì)照品10.00 mg 于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為 200 mL/L乙醇溶解定容，搖勻，即得。

供試品溶液制備：取山藥丸劑粉末，精密稱量1.00 g，加體積分?jǐn)?shù)為 200 mL/L 的乙醇20 mL，超聲(200 W，40 kHz)提取60 min，濾過，加體積分?jǐn)?shù)為 200 mL/L乙醇定容于50 mL容量瓶中，震蕩10 min，3 000 r/min 離心20 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾即得[13]。

線性關(guān)系考察：精密吸取0.1，0.5，1，1.5，2，2.5，3，5，10 mL對(duì)照品溶液于10 mL量瓶，加200 mL/L 的乙醇定容。依次進(jìn)樣10 μL，按確定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= 9.874X+0.258，r2=0.998。結(jié)果表明:尿囊素在4～400 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

測(cè)定方法：取上述尿素囊對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL,進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)照品和不同炮制品的山藥丸供試品的色譜圖見圖1，測(cè)定結(jié)果見表4。山藥經(jīng)過炒黃、炒焦后制成的山藥丸劑尿囊素含量減少，薯蕷皂苷含量增加。由生品到炒黃、炒焦后出現(xiàn)新的色譜峰。

A.尿囊素對(duì)照品；B.山藥生品丸劑；C.山藥炒黃丸劑；D.山藥炒焦丸劑；1.尿囊素圖1 高效液相色譜圖

表4山藥丸劑中指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果

精密度試驗(yàn)：取山藥丸劑粉末，按照2.4.2項(xiàng)下“供試品溶液制備”中方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行精密度考察，計(jì)算峰面積RSD值為0.94%。結(jié)果表明:儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取山藥丸劑粉末，按照2.4.2項(xiàng)下“供試品溶液制備”中方法制備供試品溶液，按照2.4.2項(xiàng)下“色譜條件”，在時(shí)間點(diǎn)0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，考察穩(wěn)定性。結(jié)果：峰面積RSD值為0.98%。結(jié)果表明:供試品溶液穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取山藥丸劑粉末 20.00 g，平行取6份，精密稱定，按2.4.2項(xiàng)下“供試品溶液制備”中方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，考察重復(fù)性。結(jié)果：含量RSD值為1.41%。結(jié)果表明:該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知尿囊素含量的山藥丸劑粉末0.5 g，平行取6份，分別加入200 mg/L尿囊素對(duì)照品溶液 5 mL，按2.4.2項(xiàng)下“供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，計(jì)算得出尿囊素的平均加樣回收率為99.17%，RSD值為1.46%。結(jié)果表明:該方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 相關(guān)性分析

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，考察物性參數(shù)與指標(biāo)成分、主要成分間相關(guān)性。結(jié)果見表5。

表5物性參數(shù)與主要成分相關(guān)性分析結(jié)果

n=3

注：**P<0.01。

3 討 論

中藥炮制是根據(jù)中醫(yī)藥理論，依照辨證論治用藥的需要和藥物自身性質(zhì)，以及調(diào)劑、制劑的不同要求所采取的制藥技術(shù)[14]。古人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)中藥飲片“制其性、形、色、味”的重要性，現(xiàn)如今將中藥飲片炮制歸結(jié)于其形、色、氣、味而的改變。飲片經(jīng)過炮制后可加工成不同劑型，丸劑有著便于攜帶、服用方便、保質(zhì)期長、免煎煮等優(yōu)點(diǎn)。丸劑的制作過程中存在著飲片物性的變化，而物性是指物質(zhì)固有的物理和化學(xué)屬性。對(duì)中藥飲片及其炮制品，一般從形、色、氣、味、質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，而這些評(píng)價(jià)指標(biāo)可以通過物性參數(shù)(相對(duì)密度、過氧化值、吸水膨脹度、pH值)等進(jìn)行數(shù)字化度量，可通過炮制過程中小分子成分含量的變化來優(yōu)選出符合中藥炮制整體現(xiàn)的動(dòng)態(tài)變化指標(biāo)，利用這些指標(biāo)控制中藥炮制過程，使中藥炮制智能化。

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定3種山藥炮制品丸劑的物性參數(shù)發(fā)現(xiàn)：隨著炮制程度的加深，山藥丸劑的相對(duì)密度、pH值、過氧化值增大，山藥炒黃吸水膨脹度最大。中藥飲片在炮制過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生褐色成分，同時(shí)伴隨pH值和過氧化值的變化。隨著炮制溫度的升高、炮制時(shí)間的增加，藥材的質(zhì)地變硬，從而導(dǎo)致吸水減少；隨著炒制程度加深，藥材粉性增加，從而吸水增加。隨著炮制程度的加深，總淀粉含量減少，其中以支鏈淀粉減少尤為明顯，說明炮制的過程加速了淀粉的分解。另外，隨著炮制程度加深，尿囊素的含量減少，薯蕷皂苷含量明顯增加，說明炮制也會(huì)對(duì)山藥飲片中的小分子成分產(chǎn)生影響。圖1中有新的色譜峰出現(xiàn)，表明炮制過程中產(chǎn)生了新的化合物，由此可知，炮制對(duì)山藥飲片中小分子成分產(chǎn)生了一定的影響。

本次實(shí)驗(yàn)可以看出，炮制后的山藥丸劑物性參數(shù)與有效成分之間具有一定的相關(guān)性，山藥不同炮制品丸劑物性參數(shù)間存在差異(P<0.05)。pH值、過氧化值、相對(duì)密度與總淀粉含量均成顯著負(fù)相關(guān)。物性參數(shù)和指標(biāo)成分含量相關(guān)性分析表明，pH值、過氧化值、相對(duì)密度與尿囊素含量成顯著負(fù)相關(guān)，與薯蕷皂苷含量成顯著正相關(guān)。從飲片到炮制品再到丸劑以整體觀來看，物性和炮制工藝間有著一定的傳遞性，炮制會(huì)改變中藥物性參數(shù)和小分子成分的含量，可通過物性參數(shù)與成分含量間的相關(guān)性來更加全面科學(xué)地對(duì)中藥炮制理論進(jìn)行研究。

中藥炮制需要現(xiàn)代化、智能化。山藥丸劑有效成分、指標(biāo)成分及物性參數(shù)三者間存在著一定的關(guān)聯(lián)性，可以進(jìn)一步考察丸劑有效成分的溶出實(shí)驗(yàn)，根據(jù)指標(biāo)成分構(gòu)建一定的線性回歸模型，為中藥飲片制丸提供一定的數(shù)據(jù)參數(shù)。如何通過物性參數(shù)指標(biāo)的制定使中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)現(xiàn)中藥飲片炮制的智能化、數(shù)字化，本實(shí)驗(yàn)可為之奠定部分基礎(chǔ)。