呂順燕，李楠，何于雯，孟錦昕，楊紹昌，3，王靜林*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.昆明市東川區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 昆明 654100；3.雙江縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，云南 雙江 677399)

云南省位于我國(guó)的西南部，與蟲(chóng)媒病毒高流行地區(qū)東南亞多個(gè)國(guó)家直接接壤，氣溫高，降雨量豐富，是我國(guó)存在蚊蟲(chóng)種類(lèi)和發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)媒病毒種類(lèi)最多的省份[1,2]。1987年首次在云南省西雙版納州具有不明原因發(fā)熱、腦炎患者的腦脊液和血清標(biāo)本中分離到一種新的12節(jié)段病毒，根據(jù)病毒分離地點(diǎn)命名為版納病毒(Banna virus，BAV)[3]。隨后證實(shí)了版納病毒廣泛分布于印度尼西亞、越南、老撾[4-6]等東南亞國(guó)家以及中國(guó)甘肅、山西、山東、遼寧、內(nèi)蒙古、湖北等多個(gè)地區(qū)[7]。由于多次直接從病人標(biāo)本中分離到版納病毒，并在不明原因發(fā)熱和病毒性腦炎患者血清中篩查到版納病毒IgM和IgG抗體[2]，這些研究結(jié)果表明了版納病毒可能是一種引起人類(lèi)發(fā)熱和病毒性腦炎的重要新發(fā)傳染病的病原體，引起了國(guó)內(nèi)外病毒學(xué)家和疾病預(yù)防控制專家的廣泛關(guān)注[8]。因此，為了解云南省師宗縣BAV傳播媒介蚊蟲(chóng)種類(lèi)及攜帶版納病毒分子特征，本研究采用BAV 12節(jié)段特異引物對(duì)2013年在云南珠江上游地區(qū)采集的蚊蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行BAV核酸檢測(cè)，并對(duì)蚊蟲(chóng)攜帶的BAV 12節(jié)段基因進(jìn)行序列測(cè)定和分析，為該地區(qū)蟲(chóng)媒病毒的研究以及當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)人或動(dòng)物蟲(chóng)媒病毒病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲(chóng)標(biāo)本來(lái)源

2013年7月，在云南省師宗縣五龍鄉(xiāng)水寨村、下魯木村和高良鄉(xiāng)魯古村、舍里村4個(gè)村居民區(qū)附近的牛圈和豬圈，采用燈誘方法采集蚊蟲(chóng)標(biāo)本，在體視顯微鏡下根據(jù)蚊蟲(chóng)形態(tài)學(xué)特征對(duì)采集的蚊蟲(chóng)進(jìn)行分類(lèi)鑒定，共采集到庫(kù)蚊、按蚊、伊蚊、Lufzia和阿蚊5個(gè)屬的7種蚊蟲(chóng)3705只，分88批進(jìn)行研磨[9]，-85℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒RNA提取和第一鏈cDNA合成

取蚊蟲(chóng)研磨懸液200μL采用RNAiso Plus (Takara，大連寶生物) 按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，最后用20μL無(wú)RNase的DEPC處理水溶解RNA。采用PrimeScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑(Takara 大連寶公司) 按說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。

1.3 PCR擴(kuò)增和克隆

采用版納病毒第12片段特異引物(12-854-S：AAATTGATAGYGYTTGCGTAAGAG；12-B2-R：GTTCTAAATTGGATACGGCGTGC)[10]對(duì)2013年在云南省師宗縣采集的88批蚊蟲(chóng)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20μL，即cDNA 2μL、 10×Buffer 2μL、 2.5mmol /L dNTP 2μL、上(12-854-S)下(12-B2-R)游引物各0.5μL、exTaq酶0.3μL、去離子水12.7μL，充分混勻，94℃預(yù)變性5min、94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，1%瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增條帶，PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送擎科生物工程技術(shù)有限公司(昆明)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列分析

使用MEGA X軟件中ALIGN進(jìn)行病毒基因序列和推測(cè)的氨基酸序列比對(duì)，使用DNASTAR軟件中MegAlign進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。使用MEGA X 軟件完成基于Neighbor joining (NJ) 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值為1000。

2 結(jié)果

2.1 版納RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

采用版納病毒12節(jié)段特異引物對(duì)2013年在云南省師宗縣采集的5個(gè)屬7種蚊蟲(chóng)88批進(jìn)行擴(kuò)增，其中1批三帶喙庫(kù)蚊(SZ32)擴(kuò)增到856bp大小電泳條帶，提示該批蚊蟲(chóng)版納病毒擴(kuò)增陽(yáng)性，其余87批蚊蟲(chóng)樣本擴(kuò)增均為陰性(見(jiàn)圖1)，蚊蟲(chóng)版納病毒批陽(yáng)性率為1.14%(1/88)。

N.陰性對(duì)照；1-7.SZ25-SZ31；8.SZ32；9-23.SZ33-SZ47；M.Marker 2000bp。

圖1 云南省師宗縣采集88批蚊蟲(chóng)標(biāo)本BAV12節(jié)段特異引物RT-PCR電泳結(jié)果

2.2 云南省師宗縣三帶喙庫(kù)蚊攜帶版納病毒遺傳進(jìn)化分析

對(duì)SZ32 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序獲得版納病毒12節(jié)段序列849核苷酸(nt)，與15株不同地區(qū)分離版納病毒和其他4株?yáng)|南亞十二節(jié)段雙鏈RNA病毒屬(Seadornavirus)代表毒株相應(yīng)序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用MEGA X 軟件中NJ方法構(gòu)建(見(jiàn)圖2)，結(jié)果顯示云南省師宗縣蚊蟲(chóng)中檢測(cè)到的SZ32與所有不同地區(qū)分離15株版納病毒位于同一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)；在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上所有版納病毒形成兩個(gè)較大的進(jìn)化分支，即A基因型進(jìn)化分支和B基因型進(jìn)化分支，A基因型進(jìn)化分支包括了中國(guó)以及越南流行的版納病毒，B基因型包括在印度尼西亞流行的病毒株；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)A基因又分為A1和A2兩個(gè)基因亞型進(jìn)化分支， A1基因亞型包括我國(guó)北方地區(qū)甘肅、山西、遼寧等地流行的病毒，A2基因亞型進(jìn)化分支包括了云南和越南流行病毒，本次在云南省師宗縣蚊蟲(chóng)中攜帶的版納病毒位于A1基因亞型進(jìn)化分支內(nèi)。

● 為本研究新分離病毒株

圖2 云南省師宗縣三帶喙庫(kù)蚊攜帶版納病毒12節(jié)段(810nt)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析(NJ法)

2.3 云南省師宗縣三帶喙庫(kù)蚊攜帶版納病毒核苷酸和氨基酸同源性分析

云南省師宗縣三帶喙庫(kù)蚊SZ32攜帶的病毒與版納病毒核苷酸同源性在82.5%～98.4%，氨基酸同源性在89%～98.7%，而與Seadornavirus其他4種病毒核苷酸同源性均低于52.4%，氨基酸同源性低于36.8%；SZ32與A基因型BAV核苷酸同源性在89.7%～98.4%，氨基酸同源性在90.8%～98.7%，而與B基因型BAV核苷酸同源性僅為85%，氨基酸同源性為89%；進(jìn)一步分析SZ32與A2基因型BAV核苷酸同源性在93.7%～98.4%，氨基酸同源性在95.6%～98.7%，而與A1基因型BAV核苷酸同源性為89.7%～91.3%，氨基酸同源性為90.8%～93.4%，見(jiàn)表1。

表1 云南省師宗縣蚊蟲(chóng)攜帶BAV與其他BAV和Seadornavirus核苷酸和氨基酸同源性分析

-：沒(méi)有進(jìn)行分型。

3 討論

1987年首次從云南省西雙版納病人標(biāo)本中分離到病毒以來(lái)[2]，相繼在位于北溫帶、亞熱帶以及熱帶(赤道至北緯42度)的中國(guó)、印度尼西亞、越南等國(guó)家分離到多株版納病毒[4-7]。本次研究采用版納病毒12節(jié)段特異引物對(duì)2013年7月在云南省師宗縣采集的5屬7種蚊蟲(chóng)88批進(jìn)行核酸檢測(cè)，其中一批蚊蟲(chóng)(SZ32)擴(kuò)增陽(yáng)性，序列分析結(jié)果顯示SZ32與所有不同地區(qū)分離15株版納病毒位于同一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)，核苷酸和氨基酸同源性分別在82.5%～98.4%、89%～98.7%，提示師宗縣蚊蟲(chóng)攜帶的SZ32為版納病毒。由于版納病毒地理分布具有明顯的地域性特征，分為基因A型和基因B型兩個(gè)基因型，基因A型又分為由北方分離株組成的A1亞型和南方分離株組成的A2亞型[7]。本次在云南省師宗縣蚊蟲(chóng)中攜帶的版納病毒與云南省以前流行的和越南等地區(qū)流行的BAV位于同一個(gè)小的進(jìn)化分支內(nèi)，A1基因亞型分支，核苷酸和氨基酸同源性也較高，分別在93.7%～98.4%、95.6%～98.7%。而與我國(guó)北方地區(qū)甘肅、山西、遼寧等地流行的A2基因亞型版納病毒位于不同進(jìn)化分支，核苷酸和氨基酸同源性分別低于91.3%、93.4%。提示本次在云南省師宗縣蚊蟲(chóng)中檢測(cè)的版納病毒為A1基因型版納病毒。

版納病毒被認(rèn)為是一種引起人類(lèi)發(fā)熱和病毒性腦炎的重要新發(fā)傳染病的病原體或潛在病原體[8]。該病毒多次從發(fā)熱腦炎病人、牛以及蚊蟲(chóng)、蜱、蠓蟲(chóng)等媒介昆蟲(chóng)中分離到，特別近年來(lái)從蚊蟲(chóng)中分離的病毒株數(shù)量最多，已在我國(guó)多地區(qū)采集的3屬10種蚊蟲(chóng)中分離到多株版納病毒。此次在云南省師宗縣采集的三帶喙庫(kù)蚊中檢測(cè)到該病毒，該蚊種是當(dāng)?shù)嘏Ｈ?、豬圈主要優(yōu)勢(shì)蚊種，也是云南省以及我國(guó)其他多個(gè)地區(qū)優(yōu)勢(shì)蚊種。提示三帶喙庫(kù)蚊可能是版納病毒主要傳播媒介之一，版納病毒在云南省乃至我國(guó)其他多個(gè)地區(qū)的蚊蟲(chóng)媒介中可能廣泛存在。本研究為了解云南省攜帶版納病毒傳播媒介種類(lèi)，探討蚊蟲(chóng)攜帶版納病毒遺傳進(jìn)化關(guān)系及基因型基因亞型分布，為進(jìn)一步了解版納病毒生態(tài)學(xué)和相關(guān)蟲(chóng)媒病毒病預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。