吳琰瑜　金穎　張光明　呂紅

摘 要：本文以表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，在15L反應(yīng)器和200L反應(yīng)器中進(jìn)行逐漸放大，研究放大策略及規(guī)模放大模型的建立，為后續(xù)商業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)一步放大提供穩(wěn)定可靠的放大策略及操作模型，為抗體藥物生產(chǎn)提供支持。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng);放大;策略;模型

0 引言

生物反應(yīng)器的規(guī)模放大是細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程開(kāi)發(fā)的基本組成部分。在研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大的過(guò)程中，有很多需要重點(diǎn)考察的因素，例如：混合時(shí)間，氧氣轉(zhuǎn)移和二氧化碳去除等。目前在生物制藥工業(yè)生產(chǎn)中，主要通過(guò)研究這些關(guān)鍵因素，進(jìn)而建立大規(guī)模、高密度的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞是目前生物制藥細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的宿主細(xì)胞，常被用于生產(chǎn)各種重組蛋白。

目前細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的工藝開(kāi)發(fā)，通常先在小規(guī)模的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，鎖定工藝后，將其逐級(jí)放大，直至用于商業(yè)化生產(chǎn)的更大的生物反應(yīng)器。目前國(guó)內(nèi)行業(yè)的反應(yīng)器規(guī)模一般可分為中試規(guī)模（200L、500L）和生產(chǎn)規(guī)模（1000L、5000L），而國(guó)外的大規(guī)模生產(chǎn)的反應(yīng)器可達(dá)到15000L。

培養(yǎng)工藝在反應(yīng)器的規(guī)模放大一直以來(lái)都是工業(yè)界具有挑戰(zhàn)性的工作。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大型反應(yīng)器相較于小型反應(yīng)器，在混合和傳質(zhì)效果上的降低會(huì)引起二氧化碳逃逸效果變差、混合時(shí)間變長(zhǎng)等問(wèn)題，進(jìn)而導(dǎo)致在小規(guī)模反應(yīng)器確立的培養(yǎng)工藝放大至生產(chǎn)的大規(guī)模反應(yīng)器時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)不如預(yù)期，表現(xiàn)為細(xì)胞密度降低、培養(yǎng)周期縮短、產(chǎn)量大幅下降或者產(chǎn)物質(zhì)量難以控制等一系列問(wèn)題。

近年來(lái)，隨著質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Quality by Design，QbD）

的理念在生物制藥領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用，越來(lái)越多的企業(yè)開(kāi)始在工藝開(kāi)發(fā)階段就開(kāi)始應(yīng)用QbD的理念。因此建立合適的適用于細(xì)胞培養(yǎng)工藝規(guī)模放大的策略和模型，對(duì)進(jìn)行穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的意義。

1 培養(yǎng)工藝的規(guī)模放大策略及可能存在的問(wèn)題

1.1 放大策略

細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程中的參數(shù)可以分為兩類(lèi)：與體積相關(guān)的參數(shù)和與體積無(wú)關(guān)的參數(shù)。不隨反應(yīng)器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù)，例如：pH、DO、溫度、補(bǔ)料時(shí)間等，這些參數(shù)在放大過(guò)程中前后兩級(jí)保持一致即可。隨著反應(yīng)器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù)，例如：通氣速率、攪拌轉(zhuǎn)速、補(bǔ)料體積等，在放大過(guò)程中會(huì)根據(jù)反應(yīng)器通氣孔徑的大小和方式，以及攪拌槳的大小和形式而發(fā)生變化。一般來(lái)說(shuō)，隨著反應(yīng)器體積的變大，通氣速率一般呈線性上升的趨勢(shì)。通氣流速的放大一般采用單位體積單位時(shí)間的通氣量（vvm）恒定的方法。其中，O2和CO2流速的放大方法在實(shí)際的操作過(guò)程中還要根據(jù)反應(yīng)器中DO和pH控制器的類(lèi)型以及工藝要求的控制策略做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在參數(shù)放大過(guò)程中，反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速的放大需要考慮的因素比較多。大型反應(yīng)器的攪拌速度需要考慮既能夠?yàn)榉磻?yīng)器提供足夠的混合能力，還要避免造成由于高轉(zhuǎn)速條件下剪切力所引起的不必要的細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)速對(duì)體積氧傳遞系數(shù)（KLa）的影響，也是在放大過(guò)程中需要考慮的一個(gè)重要因素。另外，補(bǔ)料體積等參數(shù)屬于與體積相關(guān)的參數(shù)，需要根據(jù)培養(yǎng)體積放大倍數(shù)做一定的調(diào)整。

1.2 可能存在的問(wèn)題

在反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)工藝規(guī)模放大研究過(guò)程中，目前主要集中在流體剪切力、氧傳遞、溶解二氧化碳的移除以及反應(yīng)器混合能力四個(gè)方面，這些問(wèn)題已經(jīng)成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞在放大過(guò)程中公認(rèn)的技術(shù)難題，是規(guī)模放大過(guò)中導(dǎo)致放大效果低于預(yù)期或?qū)е路糯笫〉闹饕?。也是目前哺乳?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最具挑戰(zhàn)的難點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 反應(yīng)器放大策略

反應(yīng)器規(guī)模放大模型的建立采用以下策略：①非體積相關(guān)的參數(shù)保持不變，如pH、DO、溫度、接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、補(bǔ)料時(shí)間等;②體積相關(guān)的參數(shù)（線性），如培養(yǎng)體積、補(bǔ)料添加量等;③體積相關(guān)的參數(shù)（非線性），如轉(zhuǎn)速、通氣量等。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

流加培養(yǎng)方法不變，按照補(bǔ)料策略S11每次流加初始培養(yǎng)體積F1和F2;每天根據(jù)葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果，在葡萄糖低于4g/L時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖濃縮液至濃度6g/L。培養(yǎng)收獲時(shí)間設(shè)定為14天。

15L反應(yīng)器2批，200L反應(yīng)器培養(yǎng)3批，對(duì)15L和200L

反應(yīng)器的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 反應(yīng)器規(guī)模放大與縮小

3.1.1 細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活率

按照設(shè)定好的工藝在2批15L和3批200L反應(yīng)器中進(jìn)行驗(yàn)證，如圖1所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，活細(xì)胞密度不斷增加。15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器在細(xì)胞生長(zhǎng)保持一致，從第10天開(kāi)始細(xì)胞密度維持在一個(gè)較高的水平，出現(xiàn)輕微下降的趨勢(shì)。

在細(xì)胞活率方面，如圖2所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞活率在逐漸降低，但降低幅度較低。培養(yǎng)結(jié)束第14天時(shí)15L反應(yīng)器中細(xì)胞活率是90.5%，在200L反應(yīng)器中是93.5%，均處于一個(gè)活率較高的水平，并且15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器中的細(xì)胞活率的趨勢(shì)保持一致。

3.1.2 細(xì)胞代謝

由圖3可知，2批15L和3批200L反應(yīng)器的乳酸代謝情況基本一致，從第0天到第4天為乳酸生成階段，此階段乳酸快速生成，第四天達(dá)到最高，之后進(jìn)入乳酸消耗階段，到第9天左右乳酸完全耗光。

由圖4可知，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中氨都是持續(xù)累計(jì)的過(guò)程，在培養(yǎng)前期反應(yīng)器中銨離子濃度較低，從第8天開(kāi)始反應(yīng)器中銨離子濃度逐漸增大，15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器中氨的代謝趨勢(shì)一致。

3.2 蛋白表達(dá)

圖5所示為培養(yǎng)工藝在2批15L和3批200L反應(yīng)器中的蛋白表達(dá)情況對(duì)比。由圖可知，15L和200L反應(yīng)器的蛋白表達(dá)情況基本一致，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)量均在3g/L左右。

3.3 蛋白質(zhì)量

圖6所示為2批15L和3批200L反應(yīng)器上的抗體SEC純度對(duì)比，由圖可知，不同規(guī)模反應(yīng)器的抗體SEC純度無(wú)顯著差異，最終蛋白純度均在98%左右。

綜上所述，從2批15L和3批200L反應(yīng)器中進(jìn)行的細(xì)胞工藝，在細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、乳酸代謝、氨代謝、蛋白表達(dá)和蛋白質(zhì)量六個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比，各參數(shù)在兩級(jí)反應(yīng)器中趨勢(shì)基本一致，可說(shuō)明該培養(yǎng)工藝按照既定放大策略能夠穩(wěn)定的放大至較大規(guī)模的反應(yīng)器中。

4 小結(jié)

本文首先對(duì)15L反應(yīng)器放大到200L反應(yīng)器中工藝的各參數(shù)進(jìn)行了分析討論，建立了反應(yīng)器規(guī)模放大的策略，之后在15L和200L反應(yīng)器上進(jìn)行了放大生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明15L反應(yīng)器與200L反應(yīng)器是表現(xiàn)一致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先將放大參數(shù)按照非體積相關(guān)的參數(shù)和體積相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行分類(lèi)。非體積相關(guān)的參數(shù)在放大的過(guò)程中保持不變。體積相關(guān)的參數(shù)按照線性相關(guān)和非線性相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行分類(lèi)，然后選擇相關(guān)參數(shù)合適的放大準(zhǔn)則。最后，在2批15L和3批200L反應(yīng)器進(jìn)行了放大的實(shí)施和對(duì)比，結(jié)果表明細(xì)胞在生長(zhǎng)、代謝、蛋白表達(dá)和蛋白質(zhì)量方面等方面表現(xiàn)基本一致。

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