[摘要]目的 分析2015～2016年菏澤市流行性感冒（流感）病原學分離鑒定結果，為本市未來的流感防控工作提供科學依據(jù)。方法 采集2015年10月～2016年4月哨點醫(yī)院內科門診流感樣病例（ILI）患者鼻或咽拭子標本，MDCK細胞分離培養(yǎng)，流感鑒定試劑分型鑒定。結果 流感毒株分離陽性率為27.89%（140/502）。新甲H1N1型、H3亞型、BY型和BV型交替出現(xiàn)，BV型為本年度的優(yōu)勢毒株型。流感病毒分離高峰期出現(xiàn)在次年3月份。流感發(fā)病人群無性別差異，易感人群以﹤15歲兒童為主。結論 2015～2016年流感病毒不同毒株型交替出現(xiàn)，BV型為本年度優(yōu)勢毒株型。

[關鍵詞]流行性感冒；流感病毒；細胞培養(yǎng)；病毒分離

[中圖分類號] R183.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0004-04

[Abstract]Objective To analyze the results of the pathogen isolation and identification of influenza virus in Heze City from 2015 to 2016，and provide scientific evidence for the prevention and control of influenza in the future.Methods The nose or throat swab specimen of influenza-like illness （ILI） cases were collected in sentinel hospitals from October 2015 to April 2016，MDCK cells were isolated and cultureed，and influenza viruses were identified by influenza identification reagent.Results The positive rate of influenza virus isolation was 27.89% （140/502）.The types of strains were type new A（H1N1）， type A （H3N2），type BY and BV that appeared alternately，type BV was the dominant strains.The peak of influenza virus isolation appeared in March 2016.There was no gender difference in the incidence of influenza.People aged<15 years were susceptible to influenza virus.Conclusion The different subtypes appeared alternately from 2015-2016 and type BV is the dominant strains.

[Key words]Influenza；Influenza virus；Cell culture；Virus isolation

流行性感冒，簡稱“流感”，是一類由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染病，主要通過空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸傳播。多發(fā)于冬春季節(jié)，其臨床癥狀以急起高熱（≥38.5℃）、伴咽痛或咳嗽、全身酸疼，病程可持續(xù)1周或者更長，嚴重者可出現(xiàn)肺炎、心肌炎等并發(fā)癥甚或死亡現(xiàn)象。流感病毒可分為甲、乙、丙三型，其中甲型病毒易發(fā)生抗原變異，傳染性大，傳播迅速，極易發(fā)生大范圍流行，甚或世界性大流行[1]，如2009年的甲型H1N1就出現(xiàn)了世界性的大流行[2]。其是第一個全球防控的傳染病，也是我國重點防控的傳染病之一。2015年10月～2016年4月為本市流感高發(fā)季節(jié)，流感網絡監(jiān)測實驗室對哨點醫(yī)院采集的流感樣病例（influenza-like illness，ILI）標本進行流感病毒細胞分離鑒定，結果分析如下。

1材料與方法

1.1材料

2015年10月～2016年4月哨點醫(yī)院采集發(fā)病3 d或3 d內的共502份ILI鼻或咽拭子標本。ILI病例是指發(fā)熱（腋下溫度≥38.5℃），伴咽痛或咳嗽之一者。每周采集20份，低溫保存送至流感監(jiān)測網絡實驗室。

1.2實驗室分離鑒定

1.2.1細胞培養(yǎng) MDCK細胞（由山東省疾病預防控制中心病毒所流感確證實驗室提供）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、雙抗（青霉素/慶大霉素）、TPCK胰酶、牛血清白蛋白組分Ⅴ等均購自美國Gibco公司；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 美國）；流感病毒型別鑒定試劑盒由國家流感中心提供。

1.2.2病毒分離鑒定試劑及原理 24孔細胞培養(yǎng)板；人O型血紅細胞；96孔微量血凝板；流感病毒型別鑒定試劑盒[抗原、抗血清分別包括：A（H3N2）、B-Yamagata系、B-Victoria系、A（H1N1）pdm09（新甲H1N1）]：由國家流感中心提供；濃度為：1∶10。血凝試驗（hemagglutination test，HA test）原理[3]：流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有識別和結合宿主細胞表面受體的結構，能使一些特定的紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象。當紅細胞與病毒按照適當?shù)谋壤旌虾?，由于病毒的作用使紅細胞發(fā)生凝集。紅細胞凝集抑制試驗（hemagglutination inhibition test，HI test）原理[3]：特異的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制紅細胞的凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，即抗體與病毒結合后，可以使HA不吸附于紅細胞表面的受體上。

1.2.3病毒分離及培養(yǎng) 按照《全國流感監(jiān)測方案（2010年版）》[4]中《流感監(jiān)測實驗操作技術規(guī)范》的要求，將處理后的標本0.3～1.0 ml，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中75%～90%單層成片生長MDCK細胞（每例樣本接種3～6孔），吸附1～2 h，35℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d，每天觀察細胞病變（cytopathogenic effects，CPE）狀況，待CPE達到或者>70%，收集病毒液用1%人O型血紅細胞進行HA試驗，檢測病毒的存在及滴度。HA≥8的病毒液行HI測定滴度及用流感簽定試劑進行分型鑒定；HA<8的培養(yǎng)液繼續(xù)盲傳二代細胞培養(yǎng)（即將多孔的培養(yǎng)液混合然后再接種）。二代細胞培養(yǎng)液行HA仍陰性者，即為MDCK細胞病毒分離陰性。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1病毒分離鑒定的總體概況

2015年10月～2016年4月哨點醫(yī)院門急診就診患者74 991例，其中ILI患者613例，占8.17%。共采集ILI咽拭子標本502份，其中男性322例，女性180例，男女性別比例為1.78∶1，男性多于女性；0～5歲組349例，>5～15歲組115例，>15～25歲組7例，>25～60歲組25例，>60歲組6例，其中0～5歲組構成比例最高，占69.52%。細胞分離鑒定出流感毒株140株，分離陽性率27.89%（140/502）。毒株型較為復雜，新甲H1N1型、H3亞型、BY型和BV型均有出現(xiàn)，就整個監(jiān)測年來看BV型共分離出88株，占整個監(jiān)測年度陽性數(shù)的62.86%（88/140），為本年度的優(yōu)勢毒株型（表1）。

2.2不同月份流感病毒的分離鑒定情況

按照月份來看，2015年10月～2016年4月7個月份中，ILI標本檢測數(shù)逐月增多，10月、11月兩個月份未有陽性毒株出現(xiàn)。12月ILI標本檢測數(shù)達高峰并開始分離出陽性毒株，且陽性毒株數(shù)逐月增多，至次年3月流感陽性毒株分離率達峰值，為64.29%。到4月份檢測標本數(shù)下降，分離陽性率也開始下降（圖1）。

2.3不同流感病毒型別的時間分布

10月、11月未有陽性毒株檢出；12月BY型開始出現(xiàn)，且為當月優(yōu)勢株；次年1月流感陽性毒株檢出數(shù)大幅增加，且毒株型較為復雜，BY型、BV型、H3亞型及新甲H1N1型陽性株均有出現(xiàn)，新甲H1N1為該月優(yōu)勢毒株共檢出14株，占該月檢出數(shù)的56.00%；較1月份，2月份陽性毒株檢出數(shù)又有增加，毒株型與1月相同，但優(yōu)勢株轉為BV型；至3月份流感毒株陽性檢出數(shù)達高峰，該月共檢出陽性株54株，占全年檢出數(shù)的38.57%，BV型成為強勢型優(yōu)勢毒株，占本月檢出數(shù)的87.04%；到4月份，流感毒株檢出數(shù)開始下降，毒株型仍以BV型為主（圖2）。

2.4流感毒株的人群分布情況

從性別上看，陽性標本中，男性標本陽性率為27.33%；女性標本陽性率為28.89%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.140，P=0.709）。從年齡組上看，各年齡組之間陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=25.321，P=0.000）。其中>5～15歲組，陽性率最高為44.35%；次高組為0～5歲組，其陽性率為24.64%。在0～5歲組，新甲H1N1型、H3亞型、BY型和BV型四種毒株型均有出現(xiàn)，BV型占比例最高為49例，其次為新甲H1N1型占28例；>5～15歲組，四種毒株型也均有，以BV型為優(yōu)勢株；>25～60歲組H3亞型與BY型各檢出1例；>15～25歲組、>60歲組均未檢出陽性病例（表2）。

3討論

流感病毒在自然界中宿主分布廣泛、基因組結構復雜、基因易發(fā)生突變和重配，這使流感病毒成為人類健康的重大威脅。流感病毒表面抗原HA和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）的變異有兩種形式，即抗原性漂移和抗原性轉變。抗原性漂移變異幅度小，屬亞型內變異，由病毒基因點突變和人群免疫力選擇所造成，可引起小規(guī)模流行；抗原性轉變變異幅度大，病毒表面抗原結構發(fā)生變異，形成新亞型，由于人群對變異毒株缺少免疫力而容易造成新型流感的大流行[1，5]。如果不同型別病毒同時流行，可發(fā)生基因重組而形成新亞型流行性感冒。流感監(jiān)測是季節(jié)性流感防控和流感大流行應對與準備的一項重要策略，通過系統(tǒng)的監(jiān)測可以明確流感的流行毒株并及早發(fā)現(xiàn)變異株，同時可以有效應對流感暴發(fā)疫情或流感流行[6]。

流感在中國南方省份與北方省份發(fā)病高峰時段不同，南方省份高發(fā)月份為6～8月份[7]，北方省份高發(fā)期一般為12月～次年1月[8]。山東省為北方省份，流感的高發(fā)期為12月～次年1月[9]。菏澤市位于魯西南地區(qū)，每年的流感高發(fā)季節(jié)特點與山東省基本一致[10]。本市流感病毒分離鑒定結果顯示，2015年10月～2016年4月流感病毒分離鑒定陽性率為27.89%。毒株型較為復雜，新甲H1N1型、H3亞型、BV型和BY型均有出現(xiàn)，其中BV型毒株共分離出88株，占全年陽性數(shù)的62.86%，為本監(jiān)測年的優(yōu)勢毒株型。流感病毒分離高峰值出現(xiàn)在次年3月，與其他地市監(jiān)測結果稍有不同[11-12]，這可能與本地區(qū)2015年初冬季節(jié)的一場降雪有關，氣溫驟降致使流感病毒高發(fā)期延后。不同月份優(yōu)勢毒株型不同，新甲H1N1型在次年1月出現(xiàn)并很快成為優(yōu)勢株；隨著時間的推移，BV型出現(xiàn)并逐漸替代新甲H1N1型成為次年2～4月的優(yōu)勢毒株型，可能與本地區(qū)冬季的溫度變化及鄰近2016年春節(jié)外來人口流動性較大有關。從人群特征上看，流感的主要易感人群還是集中在學齡前（0～5歲）與學齡（>5～15歲）兒童，這與其他的報道相符[13-15]，可能與多為幼托兒童和學生密切接觸流感更易傳播有關。此結論可以看出在流行性感冒來臨之前，預防接種流感疫苗并推廣流感疫苗在學生人群中的接種率，對于防治流感有積極作用[16]。

流感病原學監(jiān)測是預防流感的重要技術手段，通過監(jiān)測及時發(fā)現(xiàn)流感的流行趨勢與規(guī)律，為流感防控工作提供科學依據(jù)。在流感暴發(fā)或者大流行之前提出預警，盡量減少流感為公眾健康和公共衛(wèi)生帶來的危害，減少因流感為公眾家庭帶來的經濟負擔。

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