何驍+鄧莉莉

[摘要]目的 觀察兔自體骨髓基質細胞作為種子細胞移植修復兔坐骨神經長距離缺損的能力及其安全性，探討骨髓基質細胞在坐骨神經損傷模型內分化為神經元樣細胞的可行性。方法 兔骨髓基質細胞分離培養(yǎng)、誘導、鑒定以及傳代后注入坐骨神經損傷的兔模型中，并于細胞移植后第1、2、4、8及16周分別行透射電鏡及免疫組化等方法觀察。結果 移植側與對照側神經纖維均有不同程度再生，但對照側較移植側神經纖維數(shù)量明顯減少（t=175.88，P<0.01）。結論 BMCSs移植能促進兔坐骨神經功能障礙的恢復，并與本身相容性良好，為細胞替代療法提供了樂觀的應用前景。

[關鍵詞]骨髓基質細胞；細胞培養(yǎng)；自體移植；坐骨神經

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0013-04

[Abstract]Objective To observe the ability and safety of autologous bone marrow stromal cells （BMSCs） as seed cells in repairing long distance defect of sciatic nerve in rabbits，and to explore the feasibility of BMSCs differentiating into neuron-like cells in sciatic nerve injury model.Methods BMSCs were injected into rabbit model of sciatic nerve injury，after isolated，cultured，induced，and identificated.Then electron microscope and immunohistochemisty were performed at the 1st，2nd，4th，8th and 16th weeks after cell transplantation.Results After transplantation，there were different degrees of regenerated nerve fibers between transplanted side and controlled side，but the number of nerve fibers was significantly reduced in control group，compared with the transplantation group （t=175.88，P<0.01）.Conclusion BMCSs transplantation has a well compatibility，which can promote the recovery of rabbit sciatic nerve dysfunction and provide an optimistic application prospect for cell replacement therapy.

[Key words]Bone marrow stromal cell；Cell culture；Autotransplantation；Sciatic nerve

長距離周圍神經缺損的傳統(tǒng)治療方法是自體神經移植，但此治療方式存在嚴重缺陷，如為獲取供體而導致的其他功能損害。目前干細胞的研究已逐漸深入，關于骨髓基質細胞（bone marrow stormal cells，BMSCs）自體移植修復長距離神經系統(tǒng)損傷的研究也越來越多，并逐漸成為熱點[1]。作為自身組織，骨髓具有來源豐富、取材容易、高分裂增殖性、多組織分化潛能及不受免疫排斥等優(yōu)點，這為細胞移植療法提供了樂觀的應用前景[2]。

本研究旨在識別、跟蹤移植后BMSCs的存活狀態(tài)及與宿主神經組織整合情況，最終為其進一步行體內自體移植治療的實驗應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

選取體重為1.5～2.0 kg、約3月齡的新西蘭兔（New Zealand Rabite）10只，均由南華大學動物中心提供。

1.2試劑

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、兔神經巢蛋白（nestin）抗體由Santa Cruz公司提供；FITC標記山羊抗小鼠IgG、生物素標記山羊抗小鼠IgG試劑盒均由Chemicon公司提供；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）由R&D公司提供；PKH67染料試劑盒、3，3-二氨基苯聯(lián)胺試劑盒（3，3-diaminobenzidinetetrahydrochloride，DAB）、細胞表皮因子（epidermal growth factor，EGF）、淋巴細胞分離液（percoll）、鼠抗單克隆神經元特異性烯醇化酶（NSE）抗體均由Sigma公司提供；神經干細胞培養(yǎng)基來自于南方醫(yī)科大學實驗室，專利號為02134314.4。

1.3主要器材

組織剪、彎鉗、有齒鑷、血管鉗、顯微器械1套、縫針、無菌縫線、注射器、無菌操作臺等。

1.4實驗步驟

1.4.1骨髓采集、BMSC的分離、擴增及體外誘導 于兔耳緣靜脈將10%水合氯醛注入致其麻醉后，在無菌操作臺上抽取股骨遠端骨髓約4 ml。所獲取的骨髓用Hank液稀釋，細胞懸液與淋巴細胞分離液按1∶2比例混合，2500 r/min梯度離心15 min。將含核細胞的界面層吸出，加入1～2 ml雙蒸水吹打，加入干細胞培養(yǎng)基，800 r/min離心約5 min，去除上清后加相同培養(yǎng)基，并加10%胎牛血清接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中（圖1）。收集第三代細胞胞懸液加入本實驗室配制的神經干細胞培養(yǎng)液及EGF（10 ng/ml）+LIF（10 ng/ml）+b-FGF（10 ng/ml）+FBS（1%終濃度），接種于24孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5 d（圖2）。

1.4.2兔坐骨神經損傷模型的制作 兔稱重從耳緣靜脈注入10%水合氯醛致麻醉后，于雙側髖部消毒，置于無菌臺并鋪手術單。行髖關節(jié)后入路，依次切開皮膚、皮下、淺深筋膜，仔細止血，彎鉗鈍性分離臀大肌，顯露坐骨神經分叉處。在分叉上方切開神經外膜，切除約8 mm長神經。用微量注射器吸取神經干細胞并注入神經缺損區(qū)內，縫合神經外膜及肌膜以加強對移植干細胞的包裹力。對照側注射DMEM培養(yǎng)液。移植側及對照側隨機選擇，最后用明膠海綿包裹，在皮膚外標記實驗組移植側。將兔放入清潔籠具，預防感染，觀察生命體征。

1.4.3免疫組化染色 取細胞移植手術成功后1、2、4、8、16周的實驗新西蘭兔各2只，采用1%戊巴比妥鈉以100 mg/kg注射入腹腔后麻醉。消毒后打開胸腔，暴露心臟，導管插入左心室，生理鹽水快速沖洗，將4%多聚甲醛由插管處（pH7.4）灌注500 ml固定，由原切口切開皮膚皮下并暴露、剝離含移植干細胞段的坐骨神經。

將剝離的兔坐骨神經依次移入10%～30%蔗糖（0.1 mol/L PB配制）溶液梯度浸泡，標本下沉后進行冰凍切片，片厚12 μm，貼于載玻片上。切片先進行常規(guī)普魯士藍染色，從中選擇細胞形態(tài)較好的切片再進行抗S-100免疫組織化學法染色及DAB-H2O2棕色法染色。

1.4.4透射電鏡樣品制備 將移植端坐骨神經切片，片厚50 μm，顯微鏡觀察后選取切片，用1%四氧化鋨固定30 min，50%～95%梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，包埋及滲透，純包埋劑（Epon 812）浸透過夜，聚合（37℃ 12 h、45℃ 12 h、60℃ 12 h）。對含移植細胞的紋狀體區(qū)域在體視顯微鏡下進行超薄切片，片厚50 nm左右，由2%醋酸雙氧鈾（10 min）和枸櫞酸鉛（3 min）雙重染色后在電子顯微鏡下觀察，并進行拍照記錄。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件處理對照側、移植側各組織神經纖維數(shù)量（各取6張切片，每張切片選8點統(tǒng)計纖維條數(shù)），計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，統(tǒng)計方法為配對t檢驗，α水平為0.05。

2觀察指標及結果

2.1染色觀察

通過HE染色對組織進行觀察，各只兔移植側與對照側神經纖維均有不同程度再生，但對照側神經纖維稀疏，較移植側神經纖維數(shù)量明顯減少，切片見明顯的神經不連續(xù)，基質黏液變較移植側改變明顯（圖3）。移植側神經纖維較對照側明顯增多，且排列較整齊。術后4周和8周，移植側形態(tài)上無顯著差別；移植后16周神經纖維有序排列，S-100免疫組化染色可見施萬細胞核均勻分散在神經纖維及神經束之間（圖4）。移植治療側神經纖維數(shù)量為2126.63±23.76，高于對照側的914.13±19.65，差異有統(tǒng)計學意義（t=175.88，P<0.01）。

2.2透射電鏡檢查

透射電鏡下觀察，移植后8周內在宿主坐骨神經缺損處神經樣細胞與移植細胞之間未觀察到有明顯突觸樣結構，但移植16周標本可見移植細胞的突起伸向宿主施萬細胞突起或膠質突起，兩者之間可見少量突觸形成（圖5）。

3討論

在臨床治療中，周圍神經損傷是一類殘疾率高、治療困難的疾病[3]，臨床上再生修復效果常不理想[4-5]，這不僅給社會帶來沉重的負擔，同樣給家庭帶來了巨大痛苦。作為一種治療神經系統(tǒng)損傷的方法，細胞移植開辟了一條的新途徑[1，6-7]。2007年1月，Hu等[8]提取恒河猴自體BMSCs移植在尺神經缺損處，并與自體神經移植進行比較，結果顯示，BMSCs移植與自體神經移植術后神經恢復效果相當，這為BMSCs用來修復動物周圍神經損傷提供了有力的證據(jù)。

BMSCs是成體干細胞，與其他干細胞相比有顯著優(yōu)越性[9]。由于BMSCs具有來源廣泛、強大的再生及分化潛能，且移植后體內排斥反應弱，并可以在誘導及相應環(huán)境下分化出神經元和神經膠質細胞等優(yōu)點[10-13]，因此，BMSCs移植治療神經損傷一直是人們探索的目標。2006年6月，Hou等[14]先在體外將BMSCs誘導分化，然后將分化后的MSC插入導管中來橋接大鼠坐骨神經損傷，手術后3個月顯示，移植組橋接管內MSC在組織學上具有較完整的再生神經結構，復合肌動作電位（CMAP）的波幅、再生神經組織百分比、有髓神經纖維密度、軸突平均直徑、髓鞘厚度等參數(shù)均高于未移植BMSCs的對照組，并在神經移植物遠端觀察到大量S100和NF陽性的神經纖維。2013年9月，Salomone等[15]將誘導、培養(yǎng)的BMSCs移植到面神經損傷的大鼠實驗模型，在觀察12周后進行CMAP測量及組織學評價，結果顯示，移植組再生神經的傳導速度有了明顯改善，CMAP波幅有了明顯升高；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量的再生軸突。經過以上實驗研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs與周圍神經有著及密切的關系[16-18]。

通過本實驗觀察到：①分離的BMSCs在體外培養(yǎng)3～4 d后能夠迅速貼壁生長，貼壁后細胞形態(tài)為有多個突觸的梭形或多角形，隨后細胞開始分裂增殖，表現(xiàn)出克隆生長的特性。通過傳代培養(yǎng)可去除非黏附細胞，這些細胞有可持續(xù)培養(yǎng)增殖的能力，提示BMSCs具有很強的再生能力。②在持續(xù)誘導、培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，分離、誘導的BMSCs可形成細胞克隆團，并逐漸出現(xiàn)出芽現(xiàn)象，由此形成細胞胞突，并彼此發(fā)生聯(lián)系，最終突起伸長連接成網狀結構，呈典型的神經細胞形態(tài)。該結果提示BMSCs具有分化為組織細胞的潛能。③2014年，Mohammadi等[19]取大鼠的BMSCs進行體外培養(yǎng)、擴增并標記，移植入坐骨神經損傷的大鼠模型中，對照組移植磷酸緩沖鹽水，手術后4、8、12周觀察大鼠行為及形態(tài)組織學，結果顯示，再生纖維的形態(tài)定量分析顯移植側的纖維數(shù)量和直徑均顯著高于對照組。本實驗也觀察到自體骨髓源性神經干細胞移植兔坐骨神經缺損有利于神經纖維的修復，對照組比自體移植組神經纖維生長有明顯差異，自體移植組明顯優(yōu)于對照組。

綜上所述，兔骨髓基質源神經干細胞移植后，可在自體坐骨神經內存活、遷移、分化，且無明顯排斥反應。

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（收稿日期：2016-11-01 本文編輯：祁海文）