韓 冰，苗成利，張 林，高川成，肖鳳君，王立生，

（1.吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院康復(fù)教研室，吉林 長春 130021；2.北京大學(xué)國際醫(yī)院腹膜后腫瘤外科，北京102206；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

腹膜后脂肪肉瘤（retroperitoneal liposarcoma，RPLS）是腹膜后肉瘤的最常見類型，約占腹膜后軟組織肉瘤的45%[1]。其在發(fā)病初期并無癥狀，因此，患者在被確診時(shí)腫瘤體積往往巨大，已侵占腹腔內(nèi)臟器，使手術(shù)難以完全切除，導(dǎo)致術(shù)后易復(fù)發(fā)且預(yù)后較差[2-3]。該病目前主要的治療手段為手術(shù)切除，尚缺乏其他有效的治療方法，亟需研發(fā)能有效治療RPLS的藥物。利用新型的篩選模型評(píng)價(jià)已上市藥物老藥新用模式是節(jié)省人力、財(cái)力和時(shí)間成本的有效策略[4-5]。秋蘭姆衍生物雙硫侖（disulfiram，DSF）作為醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）的抑制劑，是一種歷史悠久的戒酒藥[6]。近些年，由于其在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)良的抑制腫瘤作用而備受關(guān)注[7-11]。脂肪肉瘤細(xì)胞由于其獨(dú)特的代謝特點(diǎn)而對(duì)多種化療藥物具有抗性。我們?cè)诤Y選對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞具有抑制作用的化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)DSF能有效抑制脂肪肉瘤細(xì)胞的生長，但對(duì)其作用特點(diǎn)及機(jī)制并不清楚。

從細(xì)胞死亡入手可很好闡釋抗腫瘤藥物的作用機(jī)制。近年來一些新型細(xì)胞死亡方式機(jī)制的研究不斷深入，如細(xì)胞鐵死亡（ferroptosis）是一種新發(fā)現(xiàn)的依賴于鐵離子及與活性氧誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)的調(diào)節(jié)性死亡方式[12]。細(xì)胞鐵死亡可被鐵離子螯合劑Fer-1逆轉(zhuǎn)[13]。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是高度炎癥細(xì)胞的死亡形式之一，其機(jī)制主要通過炎癥小體激活胱天蛋白酶1并促進(jìn)炎癥因子分泌多種炎癥調(diào)節(jié)分子如腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）（A20）等參與鐵死亡和焦亡的調(diào)控[13-14]。因此，本研究探究DSF對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872的抑制作用，并闡明炎癥小體和A20等炎癥調(diào)節(jié)分子在DSF誘導(dǎo)脂肪肉瘤細(xì)胞死亡中的作用，以期為RPLS的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器

脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872購于美國菌種保藏中心（ATCC），將細(xì)胞從液氮中取出，置37℃水浴鍋中快速化開，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)液，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)；DMEM（Gibco公司，美國）；FBS（四季青，中國）；胰酶，雙抗（Hyclone，美國）；DSF和炎癥小體NLRP3抑制劑MCC950（美國，APEBIO）；鐵離子螯合劑Fer-1（Sigma，美國）；CCK-8試劑盒（Bimake，美國）；吉姆薩染色液（索萊寶，中國）；DAPI染液（凱基，中國）；細(xì)胞凋亡雙染、SBYR熒光定量PCR試劑盒（GenStar公司，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，中國）；ALDH1A1，ALDH1A2，ALDH1A3，A20和β-肌動(dòng)蛋白引物由北京生工引物合成部合成；兔抗人TNFAIP3/A20、兔抗人三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG多抗購于中國中杉金橋公司；RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑購于中國碧云天公司。二級(jí)生物安全柜（ESCO，美國）；離心機(jī)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和多功能全波長酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國）；光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）；蛋白垂直電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司，美國）；7500 Fast實(shí)時(shí)定量PCR儀（Applied Biosystems，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國）。

1.2 CCK-8法檢測(cè)SW872細(xì)胞存活

將處于對(duì)數(shù)生長期的SW872細(xì)胞常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整到1×108L-1，并加入終濃度分別為0，1，2.5，5和10 μmol·L-1的DSF，100 μL每孔接入96孔板，每組3復(fù)孔，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。24 h后，每孔加10 μL CCK-8，37℃孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處吸光度。結(jié)果以細(xì)胞存活率表示：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）/（對(duì)照組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）×100%，并將5個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率（1-存活率）輸入SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中，利用回歸功能計(jì)算出DSF對(duì)SW872細(xì)胞的IC50。

1.3 光鏡下觀察SW872細(xì)胞形態(tài)

將處于對(duì)數(shù)生長期的SW872細(xì)胞常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整到1×105L-1，并加終濃度分別為 0，1 和 2.5 μmol·L-1的 DSF，2 mL 每孔接入6孔板中，24 h后在顯微鏡下觀察拍照。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SW872細(xì)胞凋亡

取處于對(duì)數(shù)生長期的SW872細(xì)胞，以每孔3×105接入6孔板中。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、DSF 1 μmol·L-1組和 DSF 2.5 μmol·L-1組，作用 24 h后收集細(xì)胞，用冰PBS洗2遍后用100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸，加5 μL AnnexinV-FITC，室溫避光孵育15 min，加2 μL PI，室溫孵育5 min，加400 μL PBS重懸，立即上機(jī)檢測(cè)并計(jì)算FITC+PI-陰性的細(xì)胞百分率。

1.5 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)DSF對(duì)SW872細(xì)胞克隆形成的影響

將處于對(duì)數(shù)生長期的SW872細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)，鋪于24孔板中，每孔500個(gè)細(xì)胞，500 μL體系（含10%FBS的DMEM），3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入DSF最終濃度分別為0（細(xì)胞對(duì)照組）、0.1和0.25 μmol·L-1，6 d后，細(xì)胞對(duì)照組出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落，進(jìn)行吉姆薩染色、拍照（20×）、在顯微鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)在60個(gè)以上的細(xì)胞集落。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中A20和ALDH1A1～3mRNA的水平

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)、加入藥物并調(diào)整藥物濃度為0（正常細(xì)胞對(duì)照組）、1、5和10 μmol·L-1，鋪于6孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，2 mL體系（含10%FBS的DMEM）。12 h后將細(xì)胞進(jìn)行消化離心，Trizol法提取RNA，并取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR。引物序列如下：A20上游：5′-TGCTGCCCTAGAAGTACAATAGGAA-3′，下游：3′-GCAGCTGGTTGAGTTTATGCAAG-5′；ALDH1A1上游：5′-TTGGAATTTCCCGTTGGTTA-3′，下游：3′-CTGTAGGCCCATAACCAGGA-5′；ALDH1A2上游：5′-AGGGCAGTTCTTGCAACCATGGAA-3′，下游：3′-CACACACTCCAATGGGTTCATGTC-5′；ALDH1A3上游：5′-GCCCTTTATCTCGGCTCTCT-3′，下游：3′-CGGTGAAGGCGATCTTGT-5′；β-肌動(dòng)蛋白上游：5′-CATCCTCACCCTGAAGTACCC-3′，下游：3′-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-5′。所得數(shù)據(jù)使用 2-ΔCt表示。

1.7 Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞中A20蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)、加入DSF并調(diào)整藥物濃度為1，5和10 μmol·L-1，鋪于6孔板中，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照組，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，3復(fù)孔。24 h后棄上清，使用RIPA裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白量，以相同蛋白量上樣，蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及一抗（A20和內(nèi)參GAPDH，1∶1000稀釋）4℃孵育過夜，二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體，1∶5000稀釋）搖床孵育2 h，ECL顯色后用凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶拍照，在內(nèi)參一致的情況下，觀察目的蛋白的表達(dá)，目的蛋白的積分吸光度值和內(nèi)參蛋白的吸光度值比值表示目的條帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 CCK-8法檢測(cè)鐵離子螯合劑Fer-1和NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950對(duì)DSF抑制SW872細(xì)胞增殖的影響

為檢測(cè)鐵離子和炎癥小體對(duì)DSF抑制SW872細(xì)胞的增殖的影響，利用鐵離子螯合劑Fer-1和炎癥小體抑制劑MCC950與DSF共處理細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長期的SW872細(xì)胞常規(guī)消化，計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整到1×108L-1，并加終濃度分別為0，1，2.5（或0，3，5，7.5）μmol·L-1DSF 100 μL每孔接入96孔板，每組3復(fù)孔；再在剩余含有相應(yīng)DSF濃度的培養(yǎng)液中加終濃度為 1 μmol·L-1Fer-1 或 10 nmol·L-1MCC950，充分混勻后接于同一96孔板，3復(fù)孔。24 h后，使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活狀況（方法同1.2），結(jié)果以細(xì)胞存活率表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示。采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DSF對(duì)SW872細(xì)胞增殖的抑制作用

利用CCK-8法測(cè)定DSF對(duì)SW872細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果（圖1）顯示，與正常對(duì)照組相比，DSF 1～10 μmol·L-1作用于SW872細(xì)胞24 h后，能明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.01），DSF半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.99 μmol·L-1。

2.2 DSF對(duì)SW872細(xì)胞ALDH1 mRNA水平的影響

RT-PCR結(jié)果（圖2）顯示，DSF作用于SW872細(xì)胞12 h后，ALDH1A1，ALDH1A2和ALDH1A3的mRNA水平反饋性升高。通過對(duì)不同濃度DSF作用的SW872細(xì)胞中ALDH1mRNA水平的比較，以DSF 5 μmol·L-1為最高。發(fā)現(xiàn)隨DSF 濃度增加到10 μmol·L-1，ALDH1的mRNA水平下降。

2.3 DSF對(duì)SW872細(xì)胞形態(tài)的影響

DSF作用于SW872細(xì)胞24 h后，與細(xì)胞對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)在DSF的作用下，SW872發(fā)生皺縮，變圓，細(xì)胞間隙增大，隨濃度增加現(xiàn)象越明顯（圖3）。

Fig.1 Effect of disulfiram（DSF）on viability of SW872 cells by CCK-8 assay.The cells were treated with DSF for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell contro（l0）group.

Fig.2 Effect of DSF on mRNA level of ALDH1A1-3 in SW872 cells detected by RT-PCR.The SW872 cells were treated with DSF 0，1，5 and 10 μmol·L-1respectively for 12 h.The mRNA Level of ALDH1A1-3 was detected.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.4 DSF對(duì)SW872細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，DSF作用于SW872 細(xì)胞 24 h 后，DSF 1 μmol·L-1組 SW872細(xì)胞的早期凋亡率達(dá)（32.6±1.82）%（P＜0.01），DSF 2.5 μmol·L-1組 SW872細(xì)胞的早期凋亡率達(dá)（50.17±4.27）%（P＜0.01）。

Fig.3 Morphology of SW872 cells treated with DSF for 24 h.The cells were treated with DSF 0，1 and 2.5 μmol·L-1for 24 h.Arrows show typical cell morphology.

Fig.4 Effect of DSF on apoptosis of SW872 cells detected by flow cytometry.The cells were treated with DSF 0，1 and 2.5 μmol·L-1for 24 h and stained with Annexin Ⅴ-FITC and propidium iodide.B was the quantitative result of apoptotic cells in A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.5 DSF抑制SW872細(xì)胞克隆的形成

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，細(xì)胞對(duì)照組（DSF 0 μmol·L-1）平均形成（129±5）個(gè)細(xì)胞克隆，DSF 0.1 μmol·L-1組平均形成（17±7）個(gè)細(xì)胞克?。≒＜0.01），DSF 0.25 μmol·L-1組無SW872細(xì)胞克隆的形成。

2.6 炎癥小體參與DSF對(duì)SW872細(xì)胞的抑制作用

CCK-8的結(jié)果（圖6）表明，鐵離子螯合劑Fer-1 1 μmol·L-1不能逆轉(zhuǎn)DSF對(duì)SW872細(xì)胞造成的增殖抑制，而炎癥小體抑制劑MCC950對(duì)SW872細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用，并可逆轉(zhuǎn)DSF對(duì)SW872的增殖抑制作用，表明炎癥小體參與DSF對(duì)SW872細(xì)胞的增殖抑制作用。

Fig.5 Effect of DSF on colony formation ability of SW872 cells.The cells were treated with DSF 0，0.1 and 0.25 μmol·L-1for 6 d，the colonies were stained and counted.B：The result of colony numbers of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

Fig.6 Effect of Fer-1 or MCC950 on cell viability of DSF treated SW872 cells by CCK-8.The SW872 cells were treated with DSF in the presence of Fer-1（A）or MCC950（B）for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.7 DSF誘導(dǎo)SW872細(xì)胞A20表達(dá)

DSF作用于SW872 24 h后，DSF組的A20在mRNA和蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.01）。提示A20參與DSF對(duì)SW872細(xì)胞的抑制作用（圖7）。

Fig.7 Effect of DSF on expression of A20 in SW872 cells.The SW872 cells were treated with DSF 0，1，5 and 10 μmol·L-1for 24 h.A：The level of A20 mRNA was detected by RT-PCR；B：A20 protein was detected by Western blotting；C：The qualitive result of B.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

3 討論

ALDH1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞重要的ALDH，涉及細(xì)胞中醛氧化成羧酸、維A酸和γ-氨基丁酸生物合成，也是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志分子[15]。DSF是ALDH1特異性抑制劑[16]，是一種用于戒酒的藥物。近年來研究表明，DSF能抑制肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，有可能發(fā)展成為腫瘤治療藥物[16-17]。脂肪肉瘤對(duì)于放化療敏感程度比較差，目前還缺乏有效的治療藥物[18]。本研究利用體外生物學(xué)特性檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)了DSF對(duì)SW872細(xì)胞的增殖的抑制作用。結(jié)果表明，DSF能抑制SW872細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)SW872細(xì)胞死亡，是一種SW872細(xì)胞的有效抑制劑，有可能應(yīng)用于脂肪肉瘤的治療。

體外克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，低濃度DSF使SW872細(xì)胞失去細(xì)胞貼壁能力，即可抑制SW872細(xì)胞克隆的形成。DSF的高度抑制活性與ALDH1調(diào)控腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞性有關(guān)。近年來，較多研究證實(shí)了關(guān)于化療不敏感和癌癥復(fù)發(fā)的原因是腫瘤干細(xì)胞的存在[19-20]。 ALDH1 家族（包括 ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3等）是ALDH九大家族之一，被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志性分子，具有促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞自我更新、增殖和存活的作用[21-22]。DSF作為ALDH的特異性抑制劑能抑制SW872細(xì)胞酶活性，從而導(dǎo)致ALDH1A1，ALDH1A2和ALDH1A3mRNA呈現(xiàn)反饋性增高。在DSF處理的SW872細(xì)胞中，RT-PCR的結(jié)果顯示，ALDH1A1，ALDHA2和ALDH1A3均出現(xiàn)隨濃度增加先升高再降低的趨勢(shì)，這可能是由于細(xì)胞的代償作用，在ALDH1被抑制時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)性地升高，而更高濃度時(shí)則細(xì)胞死亡所致。

大量研究表明，DSF通過抑制核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells，NF-κB）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）等經(jīng)典通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[23]。DSF的抑制作用與其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式密切相關(guān)。本研究結(jié)果也證明，DSF能誘導(dǎo)脂肪肉瘤細(xì)胞的凋亡。多種細(xì)胞死亡方式，如細(xì)胞凋亡、壞死、細(xì)胞自噬、壞死性凋亡、細(xì)胞焦亡及鐵死亡等的調(diào)節(jié)機(jī)制研究不斷深入。其中，鐵死亡是在鐵的參與下脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和致命性活性氧簇積聚導(dǎo)致的，在藥理學(xué)上能被鐵離子螯合劑，如Fer-1（含有芳烷胺的抗氧化物）等逆轉(zhuǎn)[24]。細(xì)胞焦亡則主要通過NLRP3炎癥小體介導(dǎo)[25]。利用Fer-1處理細(xì)胞并不能夠逆轉(zhuǎn)DSF的抑制作用，表明鐵死亡不是DSF誘導(dǎo)SW872細(xì)胞死亡的主要模式。NLRP3炎癥小體是細(xì)胞炎性死亡的主要通路，使用NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950與DSF同時(shí)作用于SW872細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MCC950可部分逆轉(zhuǎn)DSF對(duì)SW872細(xì)胞的抑制作用，因此，可認(rèn)為DSF在對(duì)SW872細(xì)胞的抑制過程中激活了NLRP3炎癥小體。研究結(jié)果提示，炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡參與了DSF對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞的抑制作用。

眾多調(diào)控分子參與細(xì)胞炎性死亡的調(diào)節(jié)。A20又稱為TNFAIP3，是NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)因子[26]。越來越多的研究證實(shí)，A20通過對(duì)靶細(xì)胞的蛋白泛素化修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡與壞死。在一些腫瘤中A20作為抑癌基因發(fā)揮功能[27]。近期研究進(jìn)展將A20定義為炎癥相關(guān)因子，參與炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[28]。A20可調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體，從而起到調(diào)節(jié)鐵死亡和焦亡的作用[29-31]。我們前期的研究也證明A20的表達(dá)與鐵死亡及焦亡有關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，DSF處理SW872細(xì)胞后，A20在蛋白水平和mRNA水平明顯上調(diào)，盡管在蛋白升高程度上與mRNA不盡一致，并無明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，但A20上調(diào)趨勢(shì)明顯，提示可能通過調(diào)控炎癥小體參與DSF誘導(dǎo)的SW872細(xì)胞死亡。

綜上，DSF在人脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872中具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡、抑制克隆形成的作用，其具體機(jī)制可能與DSF誘導(dǎo)SW872中A20的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，但不通過鐵死亡方式，可能與炎癥小體的激活有關(guān)。