孫靖輝，李 薇，李正祎，王春梅，李 賀，陳建光*

(1.北華大學(xué)藥理教研室，吉林 吉林 132013;2.北華大學(xué)2016級藥學(xué)研究生班，吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)教研室，吉林 吉林 132013)

隨著當(dāng)今社會生活方式的改變，人們壓力逐漸增加，疲勞成為我們值得注意的一個問題。如果人體長期處于疲勞狀態(tài)，會產(chǎn)生反應(yīng)遲鈍、注意力減退和記憶力下降等癥狀，嚴(yán)重影響生活的質(zhì)量，甚至產(chǎn)生病理性危害。因此，迫切需要開發(fā)安全、有效、可長期服用的功能食品來延緩疲勞[1]。

中藥是我國歷代醫(yī)家和勞動人民在長期的積累和探索過程中逐步發(fā)現(xiàn)而沿用至今的，是以我國特有的中醫(yī)理論為指導(dǎo)的藥物分支，其安全、低毒、療效肯定等特性使很多中藥品種成為“藥食同源”的范疇。本課題組依據(jù)中醫(yī)組方理論，選取五味子、黃芪和覆盆子為原料，經(jīng)現(xiàn)代提取制備技術(shù)配制成復(fù)方五味子口服液，該配方藥物組成及提取工藝已獲得國家發(fā)明專利[2]。本研究通過單因素正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，制成復(fù)方五味子口服液，并通過動物實(shí)驗(yàn)對其抗疲勞作用進(jìn)行功效學(xué)驗(yàn)證，為其臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

五味子由吉林省集安市五味子種植基地提供，黃芪和覆盆子購自于安圖市安興中藥飲片有限公司，以上藥材均由北華大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室王維副教授鑒定為真品；葡萄糖(廣州化學(xué)試劑廠)；輔料蔗糖、苯酚、山梨酸鉀、濃硫酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；肝糖原測試盒、乳酸測試盒、血清尿素氮測試盒(南京建成生物工程研究所)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；藥品粉碎機(jī)(江陰寶利JB-450)；Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

SPF級雄性ICR小鼠200只，平均分為4批分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，體重(20±2)g，由長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(吉)2016-0003。

2.2 復(fù)方五味子口服液的制備

取五味子、黃芪、覆盆子(1∶5∶3)，置提取罐中，加入40倍量蒸餾水(90 ℃)，浸泡30 min，水煎煮3 h，200目過濾，重復(fù)3次，合并3次濾液。提取液減壓濃縮，放置室溫后，加95%乙醇至含醇量70%，攪勻后常溫靜置24 h，過濾，得醇溶液。減壓回收乙醇，加適量純化水至總量的70%，4 ℃靜置24 h，過濾，得濾液。糖漿配制：取蔗糖加適量純化水，煮沸，攪拌溶解，趁熱過濾，添加適量熱水，攪勻，得約80%糖漿，過微濾膜，孔徑0.5 μm，壓力0.3 MPa。得到復(fù)方五味子口服液。

2.3 復(fù)方五味子口服液的提取工藝優(yōu)化

2.3.1單因素及正交試驗(yàn)

本研究通過4個關(guān)鍵單因素對多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，即料液比A(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、提取時間B(1、2、3、4、5 h)、提取溫度C(60、70、80、90、100 ℃)和提取次數(shù)D(1、2、3、4、5次)，以這4個為單因素條件分別做試驗(yàn)。

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)(A、B、C、D)4個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，詳見表1。

2.3.2苯酚硫酸法進(jìn)行多糖含量測定

精密稱取無水D-葡萄糖對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，得對照品溶液(0.1 g/L)。吸取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL分別加入25 mL比色管中，補(bǔ)水至2 mL，搖勻。依次加入5 mL濃硫酸，1 mL 6%苯酚，振蕩后，室溫放置15 min，在最大吸收波長490 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算多糖得率。

表 1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.4 復(fù)方五味子口服液的抗疲勞作用

2.4.1負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

取小鼠48只(第1批)，分為4組，分別為對照組，復(fù)方五味子口服液低、中、高(SAR-L、M、H)劑量組(給藥量為0.015、0.03、0.06 mL/kg，灌胃前將各組給藥液體量統(tǒng)一稀釋為0.02 mL/g)。SAR各劑量組給予相應(yīng)SAR溶液15 d，對照組給予同體積蒸餾水，在最后一次給藥后30 min，將小鼠單獨(dú)放入泳箱內(nèi)中(水深>30 cm，溫度25 ℃±1 ℃)。在每只小鼠的尾根上裝載鉛皮(體重的5%)，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間(力竭標(biāo)準(zhǔn)為小鼠沉入水面以下10 s不能浮出)。

2.4.2血清尿素氮測定

取小鼠48只(第2批)，分組及給藥劑量如2.4.1，在最后一次給藥后30 min，不負(fù)重游泳(水溫30 ℃)90 min，休息60 min后采血，分離血清，運(yùn)用試劑盒測量血清尿素氮的含量。

2.4.3肝糖原測定

取小鼠48只(第3批)，分組及給藥劑量如2.4.1，在最后一次給藥后30 min，不負(fù)重游泳(水溫30 ℃)90 min后立即處死，取肝臟，運(yùn)用試劑盒測定肝糖原含量。

2.4.4乳酸測定

取小鼠48只(第4批)，分組及給藥劑量如2.4.1，在最后一次給藥后30 min，采血20 μL，然后不負(fù)重游泳(水溫30 ℃)10 min后，采血20 μL，試劑盒測定乳酸含量，并計(jì)算游泳前后乳酸升高百分比。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方五味子口服液的制備工藝研究

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以不同濃度的葡萄糖對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，計(jì)算出濃度和吸光值之間的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=2.127 4x+0.009 9，R2=0.999 7，用于進(jìn)行多糖含量的計(jì)算。

2.1.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)料液(g∶mL)比為1∶30時，多糖得率達(dá)到最大值，故選擇1∶20、1∶30、1∶40作為下一步的正交試驗(yàn)的因素水平；多糖得率在提取時間為4 h時最大，所以選擇3、4、5 h作為正交試驗(yàn)的因素水平；提取液中多糖的含量隨著溫度的升高而升高，提取溫度大于80 ℃后多糖得率升高變緩，選擇70、80、90 ℃作為正交實(shí)驗(yàn)的因數(shù)水平；提取次數(shù)為3次時，多糖得率最高，選擇2次、3次、4次作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.1.3正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2中正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析可知(A:料液比，B:提取時間，C:提取溫度，D:提取次數(shù))，因素A中k2>k3>k1，因素B中k1>k3>k2,因素C中k3>k1>k2,因素D中k2>k3>k1,但R值A(chǔ)>C>D>B，可知各因素對提取液中多糖的影響由大到小依次為料液比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間。最佳因素的水平組合為A3B1C3D2，即料液比1∶40，提取時間3 h，提取溫度90 ℃，提取次數(shù)3次?？偠嗵瞧骄繛?0.84%。

表 2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 復(fù)方五味子口服液對小鼠力竭游泳時間、血清尿素氮、肝糖原和乳酸的影響

如圖1所示，與對照組小鼠相比較，復(fù)方五味子口服液各劑量組均能夠明顯增加小鼠竭力游泳時間增加(P<0.05或P<0.01)和肝糖原含量(P<0.05或P<0.01)，并能顯著降低小鼠血清尿素氮水平(P<0.05或P<0.01)和血清乳酸生成百分比(P<0.05或P<0.01)。

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

圖 1 復(fù)方五味子口服液對小鼠力竭游泳時間(A)、血清尿素氮(B)、肝糖原(C)和乳酸(D)的影響

3 討 論

抗疲勞效果可通過運(yùn)動耐量的增加去測量。強(qiáng)迫游泳運(yùn)動是最常用的行為動物模型之一，已被廣泛用于評估新化合物的抗疲勞特性[3]。血清尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，也是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的指標(biāo)。在休息時，血清尿素氮的產(chǎn)生和排泄處于平衡狀態(tài)，而在竭力游泳后，血清尿素氮明顯增加[4]。體內(nèi)尿素氮與運(yùn)動耐量之間存在正相關(guān)關(guān)系[5]。乳酸是厭氧條件下碳水化合物的糖酵解產(chǎn)物，糖酵解是在短時間內(nèi)進(jìn)行劇烈運(yùn)動的主要能量來源[6]。許多研究表明，游泳到疲憊導(dǎo)致血乳酸水平顯著升高，乳酸在血液中積聚的速度與游泳時間成反比關(guān)系[7]。肝糖原耗竭可能是疲勞發(fā)展的重要因素，因?yàn)檫\(yùn)動過程中肝糖原耗盡，無法維持血糖水平，隨之而來的低血糖可導(dǎo)致神經(jīng)功能受損[8]。因此，糖原儲存直接影響運(yùn)動能力和增加糖原儲存,有助于提高耐力和運(yùn)動能力[9]。

近年來，大量研究表明了五味子[10]、黃芪[11]和覆盆子[12]的抗疲勞作用。而從中醫(yī)藥理論來看，五味子補(bǔ)肺益氣，黃芪健脾助陽，覆盆子滋腎填精，三者通過調(diào)理肺、脾、腎三臟，達(dá)到氣、血、精三者協(xié)同共補(bǔ)，共同發(fā)揮抗疲勞的作用。因此本課題組以五味子、黃芪和覆盆子為原料，選用人們最愿意接受的口服液制劑形式，制成復(fù)方五味子口服液。經(jīng)過單因素及正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取方法為料液比1∶40、提取時間3 h、提取溫度90 ℃、提取次數(shù)3次，制成的口服液澄清透明、狀態(tài)均勻、口感酸甜。通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以提高小鼠的負(fù)重游泳時間和體內(nèi)肝糖原的含量，降低血清尿素氮和血乳酸的水平，有助于提高小鼠的運(yùn)動能力和運(yùn)動后的恢復(fù)，是一種值得推薦并具有廣闊發(fā)展前景的功能保健食品。