摘要 目的 探討食管癌患者放療前血清腫瘤標(biāo)志物水平及食管癌組織中CTNNB1表達(dá)水平與放療療效的關(guān)系，為預(yù)測食管癌放療療效尋求更加便捷，廉價(jià)的腫瘤生物學(xué)指標(biāo)。方法 入組60例患者，均為不能接受手術(shù)的局部晚期患者，經(jīng)食管鏡咬檢病理診斷為食管鱗癌，根據(jù)患者放療的近期療效分為放療有效組與放療無效組，每組30例。于放療前檢測患者血清細(xì)胞角蛋白19片段（fragments of cytokeratin-19，CYFRA211）水平，采用免疫組織化學(xué)二步法檢測上述咬檢食管癌組織中CTNNB1的表達(dá)。應(yīng)用非參數(shù)分析放療前血清CYFRA211、食管癌組織CTNNB1表達(dá)水平與放療療效的關(guān)系;相關(guān)性分析血清腫瘤標(biāo)志物CYFRA211水平與CTNNB1表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 放療有效組血清CYFRA211的表達(dá)水平低于無效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.048，P=0.041）;放療有效組食管癌組織CTNNB1表達(dá)水平低于無效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.156，P=0.031）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果提示，患者血清CYFRA211與組織中CTNNB1表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.622，P<0.001）。結(jié)論 食管鱗癌患者中血清CYFRA211或癌組織中CTNNB1表達(dá)視屏升高近期放療療效較差?；颊逤TNNB1及血清CYFRA211有望成為可預(yù)測食管鱗癌放療療效的腫瘤標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞 食管癌;放療治療;CTNNB1;CYFRA211

中圖分類號? R735.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2020）10-042-04

中國為食管癌的高發(fā)區(qū)，食管癌主要以鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主。近年來，隨著放療技術(shù)的發(fā)展，放射治療已經(jīng)成為食管癌主要治療手段之一，但是放射抵抗的存在嚴(yán)重制約放療療效提高。尋找具有指導(dǎo)意義的腫瘤標(biāo)志物對評價(jià)放療效果及病情轉(zhuǎn)歸具有非常重要的臨床價(jià)值。目前針對食管癌的腫瘤標(biāo)志物較少，且特異性不明顯，細(xì)胞角蛋白19片段（fragments of cytokeratin-19，CYFRA211）為細(xì)胞角蛋白中間體亞單位之一，是人體細(xì)胞角蛋白可溶性片段，與鱗狀細(xì)胞癌密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物之一[1]，且存在獲取便捷等優(yōu)勢。CTNNB1為Wnt通路的標(biāo)志性蛋白，前期課題組證實(shí)Wnt通路活化可能與食管癌放射抵抗相關(guān)。但是檢測CTNNB1存在組織標(biāo)本獲取困難、有創(chuàng)、造價(jià)高等缺點(diǎn)。本文以接受根治性放射治療的食管鱗癌患者為研究對象，分析血清CYFRA211水平與食管癌組織中CTNNB1的表達(dá)水平及近期療效的關(guān)系，為預(yù)測食管癌放療療效尋求更加便捷，廉價(jià)的腫瘤生物學(xué)指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1研究對象

選擇2010 年1月—2016年 12 期間唐山市人民醫(yī)院病理診斷為食管鱗癌的患者為研究對象。根據(jù)組間基線特征具有可比性的原則，選擇放療有效（有效組）和放療無效（無效組）患者各30例。納入條件：①治療前 KPS 評分均大于 70 分且無嚴(yán)重其他疾病，無明顯放療禁忌證。②全部患者放療前均未行手術(shù)治療及化療，選擇根治性放療，放療為三維適形放射治療。排除條件：因化療藥物影響療效觀察的及放化同期的患者不納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 血清CYFRA211檢測方法

采集兩組晨起空腹靜脈血3mL，分離血清，以 3000r/min 離心5min，分離血清保存于-80℃ 待用。采用微粒酶聯(lián)免疫測定法（ MEIA） 檢測CYFRA211。操作步驟嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 組織CTNNB1檢測方法

采用免疫組織化學(xué)二步法檢測食管癌CTNNB1的表達(dá)。用已知陽性切片作陽性對照，陰性對照用PBS 代替一抗，由專業(yè)病理醫(yī)師診斷。CTNNB1鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PV-9000 免疫組織化學(xué)二步法檢測試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[2]陽性結(jié)果判定

CTNNB1為棕黃色顆粒，定位于胞質(zhì)和胞核中。每例選擇 2 個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù) 200 個(gè)細(xì)胞。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行結(jié)果判斷： 陽性細(xì)胞所占百分比< 25% 為1分，25%～50% 為 2 分，50%～75% 為3分，>75% 為4分;染色強(qiáng)度不著色為 0 分，1 分為淺棕黃色，棕黃色為 2 分，棕褐色為3分;以染色陽性細(xì)胞百分比評分與染色強(qiáng)度評分相乘判斷結(jié)果。

1.5 靶區(qū)勾畫及放療方法

腫瘤靶區(qū)（GTV）：食管壁厚度>0.5cm 或不含氣腔的管壁直徑>1.0cm，及腫大淋巴結(jié)，縱隔淋巴結(jié)陽性標(biāo)準(zhǔn)為短徑≥1.0cm，特殊部位如食管旁、氣管食管溝等淋巴結(jié)標(biāo)準(zhǔn)為短徑≥0.5cm，并參考食管鋇劑造影;臨床靶區(qū)（CTV）：GTV 頭腳方向各外擴(kuò)2cm，前后左右方向各擴(kuò)0.8cm，解剖屏障適當(dāng)修正;計(jì)劃靶區(qū)（PTV）：CTV 頭腳方向外擴(kuò)1cm，前后左右擴(kuò)0.5cm。三維適形放療，常規(guī)分割2.0 Gy /次、近似劑量60～66 Gy /30～33次。

1.6 放療近期療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

放療近期療效的評價(jià)參照1989年萬鈞提出的食管癌放射治療后近期療效的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]，放射治療結(jié)束1～3月后由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的放療科主任醫(yī)師分別進(jìn)行近期療效的獨(dú)立評價(jià)，評價(jià)不一致時(shí)進(jìn)行協(xié)商討論。完全緩解（CR）：腫瘤完全消失，食管片邊緣光滑，鋇劑通過順利，但管壁可稍顯強(qiáng)直，管腔無狹窄或稍顯狹窄，粘膜基本恢復(fù)正常或增粗;部分緩解（PR）：病變大部分消失，無明顯的扭曲或成角，無向腔外潰瘍，鋇劑通過尚順利，但邊緣欠光滑，有小的充盈缺損或小龕影，或邊緣雖光滑但管腔有明顯狹窄;無緩解（NR）：放療結(jié)束時(shí)病變有殘留或看不出病變有明顯好轉(zhuǎn)，仍有明顯的充盈缺損及龕影或狹窄加重。CR + PR 為放療有效組，SD + PD 為放療無效組。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。非正態(tài)分布的計(jì)量資料計(jì)算中位數(shù)及P25，P75，組間中位數(shù)比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn);CYFRA211 與CTNNB1表達(dá)的相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。 P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療有效組與無效組基線特征比較

兩組性別、年齡、病變長度、淋巴轉(zhuǎn)移、病理分級等基線臨床特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具有可比性，見表1。

2.2血清CYFRA211及癌組織中CTNNB1的表達(dá)水平與近期療效的關(guān)系

放療有效組血清CYFRA211、CTNNB1的表達(dá)水平均低于放療無效組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明血清CYFRA211、CTNNB1的表達(dá)水平與近期療效有關(guān)系，表達(dá)水平升高，放療療效較差，見表2。

2.3 血清CYFRA211與癌組織中CTNNB1表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清CYFRA211與癌組織中CTNNB1之間存在正相關(guān)關(guān)系（r=0.622，P<0.001），且關(guān)系較為密切。

3 討論

放射治療是目前食管癌主要治療手段之一，尤其是對于無法接受手術(shù)的食管鱗癌患者。然而放射治療后腫瘤的局部未控及局部復(fù)發(fā)是目前阻礙放療療效提高的瓶頸。增加放療劑量不能改善局部控制率與生存期，這表明腫瘤存在著放射抵抗。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CTNNB1可能與食管癌細(xì)胞的放射抵抗相關(guān)[4]，本文通過探討食管癌放療前血清腫瘤標(biāo)志物水平與食管癌組織中CTNNB1表達(dá)的相關(guān)性及與放療療效的關(guān)系，可為預(yù)測食管癌放療療效尋求更加便捷，廉價(jià)的腫瘤生物學(xué)指標(biāo)。

CYFRA211是人體細(xì)胞角蛋白的片段，惡性腫瘤細(xì)胞中多有表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞正相關(guān)，當(dāng)人體鱗狀上皮細(xì)胞引起惡變時(shí)，其蛋白酶易被激活，使角蛋白片段大量生成從而進(jìn)入人體血液循環(huán)中，使人體CYFRA211含量顯著升高。CYFRA211在食管癌中也有研究，但是表達(dá)情況及作用尚存在爭議。有研究顯示CYFRA211和癌胚抗原（CEA）可能有助于預(yù)測原發(fā)灶食管鱗狀細(xì)胞癌對化學(xué)放療的反應(yīng)性[5]。對于CYFRA211與放射治療敏感性的關(guān)系存在爭議，有研究顯示食管鱗狀細(xì)胞癌放射治療的療效與治療前血清CYFRA211顯著相關(guān)，CYFRA211水平高的患者的總體生存較CYFRA211水平低的患者的總體生存差，CYFRA211的低水平是良好總體生存最重要的獨(dú)立預(yù)測因子[6]。但是在另一項(xiàng)研究結(jié)果中顯示CYFRA211的血清表達(dá)水平與預(yù)后無關(guān)[7]。本文結(jié)果顯示，相對于放療有效組，放療無效組的 CYFRA211 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CTNNB1 是 Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵成分，在該信號通路中充當(dāng)?shù)诙攀沟淖饔?。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞調(diào)控因子及原癌基因也可通過 Wnt/β-catenin信號通路異常激活來促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。CTNNB1則作為經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef 結(jié)合形成復(fù)合體促進(jìn)靶基因上調(diào)，最終引起細(xì)胞發(fā)生一系列的生物學(xué)改變。在腫瘤放射學(xué)方面，Wnt/β-catenin信號通路因其會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖[8]、凋亡[9]、DNA損傷修復(fù)[10-11]等方面從而參與了腫瘤放射抗性形成。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CTNNB1可能通過Wnt/β-catenin信號通路的活化調(diào)控細(xì)胞周期而參與食管癌細(xì)胞的放射抵抗進(jìn)程[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CTNNB1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的胞漿及胞核，放療有效組與無效組間CTNNB1表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)意義，分析結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上，患者血清CYFRA211在呈現(xiàn)放射抵抗性的食管癌患者中高表達(dá)，課題組推測CYFRA211可能存在著相關(guān)性關(guān)系。通過相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，食管鱗癌患者中的血清CYFRA211值和組織中的CTNNB1表達(dá)量確實(shí)存在相關(guān)性。據(jù)此課題組分析，CYFRA211和CTNNB1可能通過某條相同或存在上下調(diào)控關(guān)系的分子通路在食管鱗癌中發(fā)揮放射抵抗作用，但是其具體機(jī)制需進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索。血清CYFRA211有望成為可預(yù)測食管鱗癌放療療效的腫瘤標(biāo)志物。

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[2020-05-15收稿]

基金項(xiàng)目：唐山市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（編號：17130238a）

作者單位：063000 河北省唐山市人民醫(yī)院