徐金鵬　祁亞男　于延沖

摘要：WRKY71是影響擬南芥開花和分枝發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，而其在種子萌發(fā)中的作用尚不清楚。本研究以擬南芥野生型（Col-0）、WRKY71過表達(dá)突變體（D27）和T-DNA插入突變體（wrky71）種子為材料，分析正常條件、鹽脅迫、干旱脅迫處理對種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：正常條件下三種材料萌發(fā)一致;鹽脅迫下尤其是LiCl處理的wrky71種子萌發(fā)率優(yōu)于Col-0，而D27則低于Col-0;干旱脅迫1 d時，D27明顯低于Col-0，隨后三者的萌發(fā)率達(dá)到一致。這說明，D27種子萌發(fā)對鹽和干旱脅迫較Col-0敏感，而wrky71相對不敏感。

關(guān)鍵詞：擬南芥;WRKY71;鹽;干旱;突變體;種子萌發(fā)

中圖分類號：S567.210.1文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2020）03-0034-04

Abstract WRKY71 is an important transcription factor which regulates the process of flowering and branch development of Arabidopsis， however， its function on seed germination is not clear. In this study， Arabidopsis wild type（Col-0）， WRKY71 overexpression mutant（D27） and T-DNA insertion mutant（wrky71） were used to analyze the effects of normal conditions， salt stress and drought stress on seed germination. The results showed that the germination rates of the three materials were the same under normal condition. Under salt stress， especially under LiCl treatment， the germination rate of wrky71 was higher than that of Col-0， while that of D27 was lower compared with Col-0. The germination rate of D27 was obviously lower than that of Col-0 after one-day drought stress， then that of different materials was similar. The results indicated that the seed germination of D27 was more sensitive to salt stress and drought stress compared with Col-0， while that of wrky71 was relatively insensitive.

Keywords Arabidopsis;WRKY71; Salt; Drought; Mutant;Seed germination

WRKY是近20年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特異轉(zhuǎn)錄因子[1]，因其N端含有近乎絕對保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名[2]。大量研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族主要在植物抗病和非生物脅迫應(yīng)答中有重要作用[2，3]，此外也參與到其它許多生理和發(fā)育進(jìn)程，如葉片衰老、開花和分枝發(fā)育、表皮毛發(fā)育和糖代謝等[4-8]。

種子萌發(fā)是生長發(fā)育的起點(diǎn)，在植物整個生命周期中占有至關(guān)重要的地位[9，10]，也是一個十分復(fù)雜的過程，受到許多內(nèi)源和外源因素的聯(lián)動影響。不同生境中的種子感知外界環(huán)境信號，啟動內(nèi)部激素信號，調(diào)控內(nèi)部基因表達(dá)，進(jìn)而控制種子在合適的時機(jī)萌發(fā)[11]。眾多研究表明，鹽和滲透脅迫會抑制或者延遲種子的萌發(fā)[12，13]。

許多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在種子萌發(fā)調(diào)控中起到重要作用，WRKY轉(zhuǎn)錄因子就是其中之一。大麥中，HvWRKY38會抑制GA誘導(dǎo)的α-淀粉酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制種子的萌發(fā)[14]。同樣水稻中，OsWRKY71和OsWRKY51協(xié)同作用也可以抑制GA誘導(dǎo)的α-淀粉酶的表達(dá)，進(jìn)而影響種子的萌發(fā)[15]。煙草中過表達(dá)小麥TaWRKY10可以增加煙草種子在NaCl和甘露醇處理下的萌發(fā)率[16]。ABA處理下擬南芥WRKY2突變體種子萌發(fā)率顯著低于野生型[17];相反，擬南芥WRKY41突變體種子的萌發(fā)則對ABA不敏感，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WRKY41可以直接調(diào)控ABA信號基因ABI3的表達(dá)進(jìn)而影響種子萌發(fā)[18]。

本團(tuán)隊之前的研究表明，WRKY71可以與FT和LFY的啟動子區(qū)域相結(jié)合，并上調(diào)其表達(dá)，從而加速擬南芥開花[8]。而且WRKY71過表達(dá)植株在高鹽度條件下依然早花，表明WRKY71可以加速擬南芥完成整個生命史而逃避鹽害[19]。然而WRKY71是否也可以加速擬南芥種子的萌發(fā)尚未可知。為此，本試驗以擬南芥野生型（Col-0）、WRKY71過表達(dá)突變體（D27）和T-DNA插入突變體（wrky71）為材料，研究其在鹽和干旱脅迫下的種子萌發(fā)情況，以期為研究WRKY71對擬南芥生活史的調(diào)控提供新內(nèi)容，并為通過分子生物學(xué)手段影響作物種子的萌發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

哥倫比亞野生型（Col-0）擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）種子為本實(shí)驗室保存，WRKY71過表達(dá)突變體（D27）和T-DNA插入突變體wrky71為之前研究所用[19]。植物材料在光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械創(chuàng)造有限公司產(chǎn)品，型號GLX-3006S-III）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：相對濕度40%～60%、溫度22℃和16 h/d光照、8 h/d黑暗。

1.2 種子消毒

將新收獲的（不超過30 d）擬南芥種子在無菌工作臺上先用含0.03% triton 的75%酒精清洗1 min，再用70%酒精清洗兩次，每次1 min，然后將種子置于無菌濾紙上晾干備用。

1.3 種子萌發(fā)與試驗處理

將Col-0、D27和wrky71干種子撒于1/2MS培養(yǎng)基上作對照，另將三種種子分別播于65 mmol/L LiCl、250 mmol/L KCl、200 mmol/L NaCl和200 mmol/L甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行脅迫試驗。每個平皿撒150粒，封口膜密封平皿，低溫（4℃）黑暗環(huán)境下春化3 d，然后放到光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗。

培養(yǎng)皿放置到光照培養(yǎng)箱后，每隔24 h進(jìn)行一次萌發(fā)率統(tǒng)計（種子露出白色胚根即為成功萌發(fā)），共統(tǒng)計5 d。試驗重復(fù)3次。萌發(fā)率（%）= 萌發(fā)種子數(shù)/培養(yǎng)皿中全部種子數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對WRKY71突變體種子萌發(fā)率的影響

Col-0、wrky71和D27三種擬南芥種子對照的最終萌發(fā)率一致，均為100%，但wrky71第2 d達(dá)到最大萌發(fā)率，Col-0和D27為第3 d（圖1）。250 mmol/L KCl脅迫下D27的萌發(fā)率受到明顯抑制，第5 d時僅為66.2%，比對照降低31.8個百分點(diǎn);Col-0受抑制程度較D27輕，第5 d時萌發(fā)率為85.6%，降低14.4個百分點(diǎn);wrky71萌發(fā)盡管前期受到明顯抑制，但第5 d時萌發(fā)率達(dá)965%，僅降低3.5個百分點(diǎn)（圖1）。由此看出，D27種子萌發(fā)相比Col-0對KCl敏感，而wrky71相對最不敏感。

65 mmol/L LiCl處理下，Col-0、wrky71和D27種子萌發(fā)率受到明顯抑制，其中5 d內(nèi)D27的萌發(fā)率始終低于Col-0和wrky71，第5 d時其萌發(fā)率僅有40.8%，比對照降低57.2個百分點(diǎn)。試驗前期（1 d和2 d），Col-0和wrky71的萌發(fā)率相當(dāng)，第3 d始后者的萌發(fā)率顯著高于前者，第5 d時二者的萌發(fā)率分別為65.5%和75.0%，比對照分別降低34.5、25.0個百分點(diǎn)（圖2）。表明D27種子萌發(fā)相比于Col-0對LiCl敏感，而wrky71相對最不敏感。

200 mmol/L NaCl處理下，Col-0、wrky71和D27種子萌發(fā)在試驗前期（1～2 d）受到明顯抑制，后期萌發(fā)率顯著提升，第5 d時三者的萌發(fā)率分別為97.0%、99.0%和90.8%，分別減少3.0、1.0、7.2個百分點(diǎn)（圖3），表明D27對鹽最敏感。試驗第2 d，Col-0萌發(fā)率高于wrky71，第3 d之后wrky71則顯著高于Col-0，說明wrky71相對于野生型對NaCl適應(yīng)較慢但耐受能力強(qiáng)。

綜上所述，不同鹽脅迫條件下，擬南芥三種種子的萌發(fā)時間和萌發(fā)數(shù)均受到一定程度的延遲和抑制，對照3 d時萌發(fā)率均達(dá)到100%，而鹽處理達(dá)到最大萌發(fā)率時需要5 d。D27種子萌發(fā)受到三種鹽脅迫的顯著抑制，而鹽脅迫下wrky71的萌發(fā)率相對于野生型有所延遲，但其最終耐受能力較高。

2.2 干旱脅迫對WRKY71突變體種子萌發(fā)率的影響

用含200 mmol/L甘露醇（Man）的1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行干旱脅迫試驗，結(jié)果表明，Col-0、wrky71和D27均在第1 d開始萌發(fā)，萌發(fā)率分別是51.3%、41.4%和14.3%，三者萌發(fā)率均受到一定影響，均低于對照，D27最明顯。第2 d時，三種擬南芥種子的萌發(fā)率均達(dá)到100%（圖4）。以上結(jié)果表明，在早期，D27種子萌發(fā)對干旱脅迫敏感性顯著高于Col-0和wrky71。

3 討論與結(jié)論

眾所周知，植物生長發(fā)育過程中會遇到多種多樣的生物與非生物因素影響，如土壤鹽分和水分含量等，它們或有利于植物的生長發(fā)育或?qū)ζ洚a(chǎn)生危害，甚至導(dǎo)致植物死亡。在長期的生物進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出一套相對完整的趨利避害機(jī)制，從而使植物在激烈的生存競爭中取得優(yōu)勢并擴(kuò)大種群數(shù)量。在植物眾多調(diào)控機(jī)制中，有一類被稱為WRKY家族的調(diào)控因子，其許多成員已被證明是植物響應(yīng)非生物脅迫的重要因子。WRKY71作為WRKY家族的重要一員，目前關(guān)于其在非生物脅迫下對種子萌發(fā)的影響未見報道。

前期研究表明，WRKY71的過表達(dá)會促進(jìn)擬南芥開花、縮短生活史以幫助擬南芥逃避鹽害。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下尤其是LiCl脅迫下，Col-0、wrky71和D27三者的種子萌發(fā)均受到抑制，但D27受到的抑制更明顯，wrky71受到的抑制最?。▓D1～圖3）。因此推測，這一方面可能是因為WRKY71的過表達(dá)會使得植物細(xì)胞內(nèi)活性表達(dá)上升、與生命活動相關(guān)的氧化酶活性增加，從而導(dǎo)致擬南芥能夠提前開花，同時由于WRKY71的過表達(dá)使得細(xì)胞代謝活躍度增強(qiáng)，導(dǎo)致植物細(xì)胞可以更多地吸收外部環(huán)境中的離子，從而對D27種子造成更大的離子脅迫，其萌發(fā)受到顯著抑制;另一方面，可能是因為D27屬鹽敏感型，相較于Col-0和wrky71表現(xiàn)出不抗鹽的表型，因此鹽脅迫下萌發(fā)最慢。到目前為止，WRKY71突變體種子內(nèi)哪些因子參與了對鹽脅迫的響應(yīng)以及如何響應(yīng)目前還不清楚，這也是今后進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

干旱脅迫下D27種子早期萌發(fā)顯著低于Col-0和wrky71，說明WRKY71的過表達(dá)使擬南芥種子萌發(fā)對干旱脅迫更為敏感，而WRKY71基因的敲除并沒有使其種子萌發(fā)對干旱脅迫不敏感，推測可能與基因功能冗余有關(guān)，這與WRKY71在開花方面的功能冗余類似[8，19]。

本團(tuán)隊前期及本試驗研究結(jié)果表明，WRKY71盡管能促進(jìn)擬南芥開花以逃避鹽害，但其在種子萌發(fā)中的作用則相反，其過表達(dá)會抑制種子的萌發(fā)。這也可能是一種逃避機(jī)制，但具體情況尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。此結(jié)果可為WRKY71轉(zhuǎn)錄因子的生物功能研究提供新思路，也可為通過分子生物學(xué)手段影響作物種子的萌發(fā)研究提供參考。

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