泰山不同海拔土壤的細菌多樣性初步分析

沈開強，韓曉彤，張鑾，李毅璞，丁延芹，杜秉海，汪城墻

（山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東 泰安 271018）

土壤中細菌的數(shù)量和種類繁多，是土壤生物類群的重要組成部分，參與土壤中幾乎所有的生化反應，在有機物分解、生物地球化學循環(huán)等方面起重要作用，對土壤肥力和生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的形成有顯著影響［1-3］。細菌對環(huán)境變化較為敏感，所以常常將土壤細菌作為評價環(huán)境的重要指標。

隨著山體海拔的升高，氣溫、降水、土壤等因素各不相同，勢必影響山體土壤細菌的群落組成和豐富度。近幾十年來，中外科學家對山體不同海拔的微生物分布差異做了大量研究工作。金裕華［4］發(fā)現(xiàn)，武夷山土壤真菌數(shù)量隨海拔升高而降低，土壤放線菌數(shù)量隨海拔升高而升高，土壤細菌和纖維素分解菌數(shù)量隨海拔升高而增加，固氮細菌和氨化細菌隨海拔的升高而降低。Bryant等［5］發(fā)現(xiàn)，落基山脈隨著海拔升高細菌類群豐富度、系統(tǒng)發(fā)育多樣性降低。張丹丹等［6］研究表明，革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌的多樣性與珠穆朗瑪峰海拔呈負相關。綜上所述，海拔因素極大程度地影響著山體土壤細菌的豐富度和多樣性。

泰山風景秀麗，是中國五岳之首［7］，被譽為“天下第一山”［8］。泰山山脈東西綿延數(shù)百千米，主峰玉皇頂位于泰安城北，海拔1 545 m［9］。泰山是山東丘陵中最高大的山脈，地層結(jié)構(gòu)為蓋層風化形成的泰山雜巖［10］，是我國最古老的地層之一。泰山氣候垂直變化明顯，年降水量隨高度增加而增加［11］，泰山多變的地理環(huán)境孕育了多種多樣的生物。隨著泰山旅游業(yè)的發(fā)展，當?shù)氐淖匀画h(huán)境發(fā)生了改變，這在一定程度上改變了泰山土壤細菌的生存環(huán)境。人為因素對泰山環(huán)境的干擾問題有待探究和解決。

本試驗研究了泰山風景區(qū)內(nèi)海拔260、850、1 500 m的土壤細菌多樣性、豐富度及群落結(jié)構(gòu)，分析了海拔因素對泰山土壤細菌群落的影響，可為研究泰山土壤細菌多樣性、分析泰山景區(qū)的環(huán)境擾動因素和探討生境保護等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取樣

取樣地點位于山東省泰安市泰山風景區(qū)內(nèi)，選取樣本共3組，分別位于海拔260 m紅門周邊（T260），海拔850 m中天門周邊（T850），海拔1 500 m玉皇頂周邊（T1500），每組3個生物學重復。土樣均為地表以下10 cm左右，且人為破壞較少處，取樣時間為2018年6月28日，取樣后立即于-20℃凍存，兩個月內(nèi)完成所有分析工作。

1.2 樣品處理

采用Illumina Miseq測序平臺，由上海派森諾生物科技股份有限公司對所取樣品進行土壤細菌多樣性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序數(shù)量

本次試驗選擇的測序數(shù)量為40 000條左右，使用QIIME軟件［12］對OTU［13］豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽取到的序列數(shù)及其對應的OTU數(shù)繪制稀疏曲線（圖1）。從圖中可以看出，曲線的斜率明顯變小，最后趨于平緩，說明各樣本檢測結(jié)果可信度高，可準確反映真實的物種豐富度、多樣性和群落特征等指標。

圖1 樣本的稀疏曲線圖

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可用來表示每個樣本群落的細菌多樣性和豐富度。常用指數(shù)有Chao1指數(shù)［14］、ACE指 數(shù)［15］、Shannon指 數(shù)［16］和Simpson指數(shù)［17］。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)兼顧群落均勻度，均與群落多樣性呈正比。為了比較不同樣本的Alpha多樣性，首先對OTU豐度矩陣中的全體樣本統(tǒng)一進行隨機重抽樣，從而校正測序深度引起的多樣性差異；隨后，使用QIIME軟件分別對每個樣本計算多樣性指數(shù)，分析結(jié)果見表1。T260的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均最大，明顯高于T850和T1500，即樣本組T260的土壤細菌群落豐富度和多樣性最高。T850的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)略高于T1500，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)低于T1500，說明T850比T1500的土壤細菌群落多樣性略高，但細菌的豐富度較低。

表1 土壤樣本的細菌群落豐富度和多樣性指數(shù)

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性可以考察不同樣本之間的群落結(jié)構(gòu)相似性與差異性。本研究通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）方法［18］，對樣本組的群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進行自然分解與排序，觀測樣本之間的差異。通過R軟件［19］對屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進行PCA分析，以二維圖像描述樣本間的自然分布特征，結(jié)果見圖2；對Unweighted和Weighted的UniFrac距離矩陣［20］分別進行NMDS分析，結(jié)果見圖3。每個點代表一個樣本，兩點之間的距離越近，表明兩個樣本之間的細菌群落結(jié)構(gòu)相似度越高。

T260有一個數(shù)據(jù)（T260.3）異常，分析時排除，其余結(jié)果生物學重復性較好。綜合分析，T1500和T850兩組數(shù)據(jù)的相似性較高，T260組數(shù)據(jù)與其他兩組數(shù)據(jù)的差異較大。由此判斷，海拔1 500 m和850 m處的細菌群落結(jié)構(gòu)相似度高，海拔260 m處與以上兩處的細菌群落結(jié)構(gòu)相似度低。

圖2 PCA分析的樣本二維排序圖

圖3 Unweighted UniFrac（A）和Weighted UniFrac（B）NMDS分析的樣本二維排序圖

2.4 樣本菌群組成分析

根據(jù)OTU測定結(jié)果，可以獲得樣本組在不同分類學水平上的群落組成情況，結(jié)果見圖4，門水平上的群落組成情況見圖5。由于T260.3在數(shù)據(jù)上與T260.1和T260.2差別很大，為排除偶然誤差影響，所有分析都將T260.3數(shù)據(jù)排除在外。

在各分類水平上，T260都表現(xiàn)出最多的群落數(shù)量，其次是T1500。T260在群落種類方面也表現(xiàn)出與T850和T1500的顯著差異。從門水平分析，T260、T850和T1500三組樣本中含量最多的均是放線菌門（Actinobacteria），所占比例分別為41.5%、48.4%和50.3%，隨著海拔增加所占比例逐漸增多。變形菌門（Proteobacteria）在T260中的含量最高，達到27.4%，在T850和T1500中分別為13.6%和14.8%。藍藻門（Cyanobacteria）在T260、T850和T1500樣本中也占有一定比例，分別為9.4%、8.1%和8.2%。軟壁菌門（Tenericutes）在三組樣本中差異顯著，T850和T1500中的含量分別為18.2%和16.7%，而T260中沒有檢測到該門類。T260中的異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）占12.0%，而T850和T1500中含量均低于0.2%。擬桿菌門（Bacteroidetes）含量差別也較大，在T260、T850、T1500中占比分別為1.7%、10.9%和9.3%。疣微菌門（Verrucomicrobia）在三組樣本中含量不高，具有隨著海拔增加逐漸減少的趨勢。纖細菌門（Gracilibacteria）在T260未檢測到，在T850和T1500中含量很少但比例相似。另外，厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、匿桿菌門（Latescibacteria）、衣原體（Chlamydiae）等均只在T260樣本中檢測到。總體分析，T260中的細菌門水平上種類最為豐富，T850和T1500的門類比例相似性較大。

圖5 樣本組門水平上的群落組成和豐度分布

2.5 樣本間的OTU聚類分析

利用R軟件在97%的相似水平上對T260、T850和T1500的序列進行OTU聚類分析，生成樣本組OTU的Venn圖（圖6）。樣本組T260、T850和T1500的平均OTU 數(shù)分別是1 958、1 023、1 173；T850的OTU數(shù)最少，相對于T260和T1500分別減少了47.8%和12.8%；T260比T1500的OTU數(shù)高66.9%。T260、T850和T1500共有的OTU數(shù)為184。T260、T850和T1500特有的OTU數(shù)分別為1 672、193和283。T260與T850共有的OTU數(shù)為205，與T1500共有的OTU數(shù)為265；T850和T1500共有的OTU數(shù)為809，明顯高于兩樣本組與T260的共有數(shù)量。從Venn圖分析可知，T850和T1500的群落相似性較高。

圖6 基于OTU的Venn圖

使用R軟件將3組樣本屬水平上的分類信息進行聚類，繪制熱圖（圖7），熱圖用顏色變化表示數(shù)據(jù)多少，將高豐度和低豐度的物種進行分類，紅色表示高豐度，綠色表示低豐度，直觀地反映了屬水平之間相似性和差異性。由圖7可以看出，T260相較于T850和T1500，Alicycliphilus、顫藍細菌屬（Oscillatoria）和IIumatobacter等的物種豐度較高。T850相較于T1500和T260，Pseudorhodoferax、無色桿菌屬（Achromobacter）和Salinirepens豐度較高。T1500相較于其余兩組，不動桿菌屬（Acinetobacter）和棲蘇打菌屬（Nitrincola）的豐度明顯較高。不同樣本組間的細菌屬水平存在明顯差異，T260與T850、T1500之間相似度較低，T850與T1500相似度較高。

2.6 菌群代謝功能預測

用菌群代謝功能預測工具PICRUSt［21］，通過將現(xiàn)有的16SrRNA基因測序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫做比較，實現(xiàn)對細菌代謝功能的預測；預測過程還考慮了不同物種16SrRNA基因拷貝數(shù)的差異?？傮w而言，3組樣本預測出的菌群代謝功能相似，其中，膜轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、碳代謝、復制修復和能量代謝的相關基因豐度較高。T260組菌株的能量代謝、細胞過程、遺傳過程和信號轉(zhuǎn)導相關基因豐度較高，T850與T1500的復制修復、轉(zhuǎn)錄、核酸代謝相關基因豐度較高。另外，3組樣本中都含有較豐富的外源物質(zhì)生物降解和代謝相關基因，可能與景區(qū)人員流動大，帶來的環(huán)境擾動有關。

圖7 結(jié)合聚類分析的屬水平群落組成熱圖

3 討論與結(jié)論

本試驗采集泰山不同海拔的土壤樣本，分析細菌群落之間的異同。低海拔樣本組T260相比于高海拔樣本組T850和T1500土壤細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)都最高，群落結(jié)構(gòu)也最豐富，這可能與海拔260 m處的土壤細菌所處環(huán)境溫度較高有關；而高海拔組溫度較低、氧氣較為稀?。?2］，所以細菌多樣性較低。另外，樣本組T850的土壤細菌豐富度指數(shù)低于T1500，測得的細菌OTU數(shù)也較少，這可能與旅游業(yè)的發(fā)展造成中天門附近土壤細菌環(huán)境破壞嚴重有關。3組樣本中都含有較豐富的外源物質(zhì)生物降解和代謝相關基因，分析可能跟景區(qū)人員流動大，帶來的環(huán)境擾動相關。人為因素給泰山不同海拔土壤細菌多樣性和豐富度帶來了或多或少的影響，造成了部分細菌群落多樣性發(fā)生改變，因此環(huán)境修復問題應受關注。