莫文艷，王鳳英，王國(guó)霞，胡俊茹，黃燕華*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣州 510640；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3. 廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；4. 廣州安芮潔環(huán)?？萍加邢薰?，廣州 510450)

黑水虻HermetiaillucensL.是雙翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻屬Hermetia昆蟲(chóng)，又名亮斑扁角水虻，幼蟲(chóng)在自然界以動(dòng)物糞便、腐爛的有機(jī)物，如腐肉、瓜果蔬菜和植物性垃圾為食，將這些廢棄物轉(zhuǎn)化為自身生物量，生產(chǎn)高價(jià)值的蛋白質(zhì)飼料，具有廣闊前景(喻國(guó)輝等，2014；胡俊茹等，2018)。因其具有繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)，已成為當(dāng)前極具開(kāi)發(fā)潛力的資源昆蟲(chóng)(柴志強(qiáng)等，2012；徐齊云等，2014；易昌金等，2018)。目前，對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的生物學(xué)特性已有一些研究(常向前等，2017；Tomberlinetal.，2002；Dieneretal.，2009)，但有關(guān)其蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育的研究還未見(jiàn)報(bào)道。姬越等對(duì)黑水虻人工飼養(yǎng)的適宜溫度進(jìn)行研究，結(jié)果表明，黑水虻卵最佳孵化溫度為32℃，在此溫度下具有最高的孵化率和最短的孵化期(姬越等，2017)。本研究在32℃下觀察黑水虻卵的胚胎發(fā)育，記錄各時(shí)期的主要特征，結(jié)合蟲(chóng)卵發(fā)育的積溫法則，死亡蟲(chóng)卵的特征，可以判斷蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育階段，預(yù)估蟲(chóng)卵孵化時(shí)間和孵化率，豐富了黑水虻發(fā)育學(xué)和昆蟲(chóng)生產(chǎn)學(xué)的研究?jī)?nèi)容，同時(shí)理論結(jié)合實(shí)際，為黑水虻卵的人工孵化技術(shù)研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 黑水虻卵胚胎發(fā)育過(guò)程觀察

黑水虻卵取自廣州飛禧特生物科技有限公司中試基地成蟲(chóng)棚。幼蟲(chóng)取食餐廚垃圾，飼養(yǎng)溫度為30±2℃。成蟲(chóng)的飼養(yǎng)溫度為30±3℃，相對(duì)濕度為50%～90%，自然光照，白天光照強(qiáng)度為2 000～20 000 Lux。待成蟲(chóng)交配產(chǎn)卵，采集集卵板上的初產(chǎn)卵塊置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在光周期L ∶D=14 ∶10，溫度為32℃，濕度為80%的人工氣候箱中(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，PRX-350B)進(jìn)行培養(yǎng)。每隔0.5 h取出孵化中的胚胎，用顯微鏡放大50倍(10倍目鏡，5倍物鏡)觀察(卡爾蔡司光學(xué)(中國(guó))有限公司，AxioScopeA1)胚胎發(fā)育情況，利用AxioVision軟件拍照，拍照完畢放回氣候箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 黑水虻卵胚胎發(fā)育研究在生產(chǎn)上的應(yīng)用

黑水虻卵聚產(chǎn)，稱(chēng)量0.0100 g初產(chǎn)蟲(chóng)卵，用酒精泡散后計(jì)數(shù)，得出單克初產(chǎn)蟲(chóng)卵的粒數(shù)為40 000～42 000粒，采用1 g卵41 000個(gè)卵粒進(jìn)行后續(xù)計(jì)算。每一批次蟲(chóng)卵待孵化前，隨機(jī)取樣3份，在分析天平上稱(chēng)取0.0100±0.0050 g蟲(chóng)卵置于載玻片中央，用不銹鋼小勺將卵塊輕輕推散，用生物顯微鏡(廣州博冠光電科技股份有限公司，605F02)觀察記錄蟲(chóng)卵發(fā)育階段、蟲(chóng)卵發(fā)育整齊度、計(jì)算蟲(chóng)卵死亡率后將玻片置于溫度為32℃，濕度為80%的氣候箱內(nèi)孵化，蟲(chóng)卵孵化完畢后，數(shù)出未孵化的卵數(shù)計(jì)算孵化率。

孵化率(%)=(100-未孵卵數(shù))/100×100

2 結(jié)果與分析

2.1 黑水虻卵胚胎發(fā)育過(guò)程

黑水虻卵呈長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)徑955.15±24.75 μm，短徑216.90±6.22 μm。剛產(chǎn)出的卵呈乳白色，隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行逐漸變?yōu)辄S色。在32℃環(huán)境中，借鑒王進(jìn)忠等對(duì)黏蟲(chóng)胚胎發(fā)育各階段的劃分方法和描述(王進(jìn)忠等，1997)，將黑水虻胚胎發(fā)育分為卵裂期、胚盤(pán)胚帶形成期、原腸形成期、胚體分節(jié)期、體壁形成期、器官形成期6個(gè)連續(xù)時(shí)期，歷時(shí)51 h完成整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程。詳細(xì)胚胎發(fā)育時(shí)序見(jiàn)表1，此發(fā)育時(shí)序表有助于判斷黑水虻存活率以及預(yù)測(cè)孵化時(shí)間。

2.1.1卵裂期(圖版A)

黑水虻蟲(chóng)卵的合子核經(jīng)有絲分裂，形成許多卵裂核，細(xì)胞質(zhì)包裹卵裂核形成合胞體，顯微鏡下可觀察到胚胎中部有大量卵黃顆粒。

2.1.2胚盤(pán)胚帶形成期(圖版B, C, D, E)

胚胎發(fā)育4 h，卵裂期形成的活質(zhì)體在卵周質(zhì)層排列成多核體層，包圍內(nèi)部卵黃，顯微鏡內(nèi)觀察到四周有空隙的蟲(chóng)卵形態(tài)。胚盤(pán)形成后(圖B)，卵內(nèi)腹部胚盤(pán)細(xì)胞分裂加速，背部形成向初級(jí)背器(圖C)。胚胎發(fā)育5 h，形成胚帶，而后下部胚盤(pán)內(nèi)陷形成胚外膜(圖D)。胚帶形成后，胚胎逐漸向卵內(nèi)部陷入，至胚胎發(fā)育的8.5 h，形成“瓶”狀的胚帶(圖E)，以后瓶上方端發(fā)育為胚胎的頭部，下端發(fā)育為胚胎的腹部。

表1 黑水虻卵胚胎發(fā)育時(shí)序

圖1 黑水虻卵胚胎發(fā)育過(guò)程Fig.1 The embryonic developmental process of black soldier fly注：卵裂期，A；胚盤(pán)胚帶形成期，B、C、D、E；原腸形成期，F(xiàn)、G；胚體分節(jié)期，H、I；體壁形成期，I、J、K；器官形成期，K、L、M、N、O、P。Note: Cleavage stage, A; blastoderm embryo formation stage, B, C, D, E; primitive intestinal formation stage, F, G; embryo body segmentation stage, H, I; integument formation stage, I, J, K; organ formation stage, K, L, M, N, O, P.

2.1.3原腸形成期(圖版F, G)

胚胎發(fā)育的11.5 h，出現(xiàn)原腸溝，原腸溝兩側(cè)不斷向胚體中部擴(kuò)展，歷經(jīng)2 h，形成不封閉的原腸。原腸形成后，胚體分為兩個(gè)胚層。貼近胚體腹部的胚層較薄，為單層細(xì)胞即外胚層，將來(lái)發(fā)育成表皮及其衍生物、神經(jīng)系統(tǒng)、消化道兩端等，遠(yuǎn)離腹部胚層較厚，為細(xì)胞群即中胚層，將來(lái)發(fā)育為真皮、肌肉、性腺組織等。

2.1.4胚體分節(jié)期(圖版H, I)

胚體發(fā)育16.5 h，分化出明顯的原頭、原軀，外胚層的胚帶上出現(xiàn)很多橫溝。同時(shí)期，胚體前端分節(jié)內(nèi)陷形成口道，胚體后端內(nèi)陷形成肛道。

2.1.5體壁形成期(圖版I, J, K)

胚體發(fā)育30 h時(shí)，出現(xiàn)淡紅色眼點(diǎn)，同時(shí)體壁背合開(kāi)始，胚體后端的外胚層從兩側(cè)向上包圍卵中部的卵黃，歷經(jīng)5 h，在背面匯合。

2.1.6器官形成期(L, M, N)

消化道發(fā)育：胚胎發(fā)育28.5 h時(shí)，胚體尾端的外胚層內(nèi)陷形成肛陷，體壁背合過(guò)程中，位于原腸兩端的內(nèi)胚層細(xì)胞相向發(fā)育，形成最終中腸，體壁背合完成后，無(wú)法再繼續(xù)觀察消化道的發(fā)育情況。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育：胚體發(fā)育35 h，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完成，胸部胸神經(jīng)塊明顯。循壞系統(tǒng)發(fā)育：胚體發(fā)育40.5 h，循環(huán)系統(tǒng)形成，背血管明顯，43.5 h時(shí)，可觀察到心臟跳動(dòng)。呼吸系統(tǒng)發(fā)育：產(chǎn)卵后44.5 h，氣管形成，黑色主氣管明顯。

2.2 黑水虻卵胚胎發(fā)育在生產(chǎn)上的應(yīng)用

通過(guò)鏡檢技術(shù)對(duì)每一批次待孵化蟲(chóng)卵進(jìn)行鏡檢觀察，初步判定該批次待孵化蟲(chóng)卵所處的發(fā)育階段、發(fā)育整齊度和蟲(chóng)卵死亡率。發(fā)育階段異常、發(fā)育整齊度差或死亡率高于生產(chǎn)要求則進(jìn)行相應(yīng)的處理，避免后期孵化過(guò)程中造成人力和物力的大量浪費(fèi)。從蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育圖制定以來(lái)，筆者所在項(xiàng)目組每天對(duì)蟲(chóng)卵進(jìn)行鏡檢，下表2為2018年每月的蟲(chóng)卵鏡檢情況(均值)?；卦诿刻?8 ∶00采收蟲(chóng)卵，采收的蟲(chóng)卵保存溫度為20～30℃，濕度為60%～80%的房間內(nèi)，早上8 ∶00鏡檢蟲(chóng)卵。

表2 黑水虻卵鏡檢數(shù)據(jù)記錄

3 結(jié)論與討論

對(duì)于胚胎發(fā)育的研究，研究者們通常用固定液將待研究卵固定、經(jīng)過(guò)一系列的處理去掉卵殼后再進(jìn)行胚胎發(fā)育的觀察(Tomberlinetal.，2002；李冰楊等，2008；寇利軒，2016)。黑水虻蟲(chóng)卵個(gè)體小、卵殼薄、且發(fā)育歷期較短，各發(fā)育階段典型特征明顯，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)蟲(chóng)卵未進(jìn)行任何處理，在其自然孵化的條件下進(jìn)行觀察，步驟簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，更加切合生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用。

黑水虻幼蟲(chóng)屬于無(wú)足型幼蟲(chóng)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，未觀察到明顯胸腹部附肢形成的特征，隨著胚體的發(fā)育，在產(chǎn)卵后的37.5 h，咀嚼式口器以及觸角發(fā)育完成。許多昆蟲(chóng)在胚胎發(fā)育過(guò)程中，胚體為更好的吸收卵黃營(yíng)養(yǎng)，會(huì)發(fā)生胚體反轉(zhuǎn)現(xiàn)象(趙欣平等，1990；張群玲等，1998；崔雙雙等，2011)。黑水虻的胚動(dòng)無(wú)反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，只是在胚體上升期時(shí)，貼近腹面的胚帶尾端向卵內(nèi)部縮回，胚體變短，而后胚帶頭端向卵內(nèi)部移動(dòng)，在胚體下降期時(shí)，胚帶頭端又回到腹部，而后胚帶拉長(zhǎng)，胚帶尾端慢慢向原來(lái)位置縮回。

在對(duì)黑水虻卵鏡檢的過(guò)程中，針對(duì)出現(xiàn)的異常情況進(jìn)行分析，尋找原因，可以豐富黑水虻卵孵化機(jī)制的研究。對(duì)蟲(chóng)卵發(fā)育進(jìn)行持續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)正常幼蟲(chóng)出殼前尾部會(huì)分泌一種疑似具有溶解卵殼功能的液體，幼蟲(chóng)通過(guò)蠕動(dòng)身體把部分液體擠到頭頂，利用口器持續(xù)頂頭頂卵殼，直到出現(xiàn)裂縫，幼蟲(chóng)從卵殼中爬出。實(shí)際生產(chǎn)中通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)存在胚胎已發(fā)育完全、幼蟲(chóng)在蠕動(dòng)但未能破殼的現(xiàn)象，可能是因?yàn)榕咛グl(fā)育過(guò)程中受到某種應(yīng)激而導(dǎo)致其破殼不成功，可能是分泌的液體不夠，也可能是自身的力量不夠，具體原因還需進(jìn)一步研究。

在實(shí)際生產(chǎn)鏡檢中發(fā)現(xiàn)，成蟲(chóng)繁育的溫濕度以及蟲(chóng)卵采收后的保存溫濕度，對(duì)黑水虻卵的發(fā)育階段以及死亡蟲(chóng)卵占比具有影響。筆者所在項(xiàng)目組2018年10月份改進(jìn)了成蟲(chóng)繁育室的溫濕控制系統(tǒng)之后，各月份蟲(chóng)卵死亡占比明顯低于2018年1月和2月，蟲(chóng)卵孵化率明顯高于2018年1月、2月，這可能是因?yàn)?月、2月成蟲(chóng)交配過(guò)程中溫度偏低會(huì)加大未受精卵比率。2018年10月前采收的蟲(chóng)卵保存在室溫中，10月后采收的蟲(chóng)卵保存在28～30℃(空調(diào)加溫)，濕度為60%～80%(加濕器加濕)的房間內(nèi)，可以看出恒溫環(huán)境中保存的蟲(chóng)卵發(fā)育更加整齊，這可能是因?yàn)槊颗x(chóng)卵的產(chǎn)卵間隔偏長(zhǎng)(產(chǎn)卵時(shí)間12 ∶00-18 ∶00，約6 h)，先產(chǎn)的蟲(chóng)卵發(fā)育快，環(huán)境溫度偏低時(shí)，單批卵的發(fā)育階段被慢慢拉開(kāi)，鏡檢到的發(fā)育階段為B-D，30℃保存時(shí)，鏡檢的發(fā)育階段為D-E，相對(duì)整齊。6月、7月、8月發(fā)育整齊度較差可能是因?yàn)楫a(chǎn)卵間隔期更長(zhǎng)所致(產(chǎn)卵時(shí)間9 ∶00-18 ∶00，約9 h)。

黑水虻蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育特征明顯，使用生物顯微鏡即可對(duì)其發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察，所需儀器設(shè)備成本低廉，一般的生產(chǎn)企業(yè)均有能力購(gòu)買(mǎi)和應(yīng)用。蟲(chóng)卵胚胎發(fā)育是黑水虻養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的的第一步也是極為重要的一步，蟲(chóng)卵孵化率、初孵幼蟲(chóng)的活力等參數(shù)直接影響后續(xù)所有生產(chǎn)流程。后續(xù)需繼續(xù)對(duì)黑水虻蟲(chóng)卵的孵化機(jī)制進(jìn)行更深一步的研究。