方潔 潘俊杰 程科軍 呂群丹

摘要 ? ?綜述了百合分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，主要包括4個(gè)方面，即百合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究;百合遺傳多樣性分析和5種分子標(biāo)記（RAPD、ISSR、SSR、AFLP、SRAP）的開(kāi)發(fā)和利用;百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法和花粉管介導(dǎo)法;百合減數(shù)分裂基因、花發(fā)育基因及抗逆性相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析。最后指出了當(dāng)前研究存在的問(wèn)題，并展望了進(jìn)一步研究的方向。

關(guān)鍵詞 ? ?百合;分子標(biāo)記;遺傳轉(zhuǎn)化;基因克隆

中圖分類號(hào) ? ?S644.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）12-0069-05 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

A ?Review ?on ?Molecular ?Biology ?of ?Lily

FANG Jie ? ?PAN Jun-jie ? ?CHENG Ke-jun ? ?LV Qun-dan *

（Lishui Institute of Agriculture and Forestry Sciences， Lishui Zhejiang 323000）

Abstract ? ?This paper reviewed the following four aspects in lily molecular biology： research progresses of lily genomics， transcriptomics and proteomics; the development and utilization of five types of molecular markers including RAPD， ISSR， SSR， AFLP and SRAP in lily genetic diversity analysis; construction of lily transformation system including Agrobacterium mediated method， gene gun bombardment method， electroporation method and pollen tube pathway method; cloning and expression analysis of genes related to meiosis， flower development and stress resistance. Finally， the current research defects and prospects of lily molecular biology were summarized.

Key words ? ?lily; molecular marker; genetic transfomation; gene cloning

百合屬（Lilium）植物屬于百合科（Liliaeeae）多年生球根植物，集藥用、食用及觀賞于一體，具有極大的商業(yè)價(jià)值。我國(guó)是世界百合起源的中心，資源最為豐富，早在1 400多年前就有人工栽培的記載[1]。2015年版《中國(guó)藥典》中收載的百合為卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）、百合（Lilium brownii F.E.Brown var. viridulum Baker）及細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.）的干燥肉質(zhì)鱗葉，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神的功效[2]，是常用的中藥處方配伍藥材。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者從分子生物學(xué)層面上研究百合的生長(zhǎng)發(fā)育和遺傳進(jìn)化，以期為百合種質(zhì)改良和高效栽培提供技術(shù)支持?；诖耍疚膶?duì)百合分子生物學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，分析了當(dāng)前存在的問(wèn)題及今后的研究方向，為百合分子育種和優(yōu)質(zhì)新品種的獲得奠定了基礎(chǔ)。

1 ? ?百合遺傳物質(zhì)解析

1.1 ? ?基因組學(xué)研究

百合的全基因組數(shù)據(jù)十分龐大（1C=36 Gb）[3]，約為水稻的80倍[4]，其重復(fù)序列較多，給測(cè)序及后續(xù)的組裝工作帶來(lái)了極大的難度，至今仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)全基因組測(cè)序。

百合的葉綠體基因組大小通常處于120～170 kb之間，相對(duì)較為容易。先前已對(duì)青島百合[5]、垂花百合[6]、東北百合[7]和麝香百合[8]等的完整葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序。隨后Kim等[9]對(duì)條葉百合、卷丹和朝鮮百合等的葉綠體基因組進(jìn)行全測(cè)序，利用這4個(gè)新的葉綠體基因組與之前的已知序列進(jìn)行比較，詳細(xì)描述了葉綠體基因組的特征，并鑒定出13個(gè)功能領(lǐng)域中的112個(gè)基因。

畢彧[10]對(duì)10個(gè)百合屬的物種進(jìn)行了完整葉綠體基因組測(cè)序，鑒定了113個(gè)不同的基因。聯(lián)合搜索到的6個(gè)百合屬葉綠體基因組，分析結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)所有的基因排序順序一致，未發(fā)生基因重新排列現(xiàn)象;并且具有豐富的AT含量。利用生物信息學(xué)技術(shù)，鑒定出1 043個(gè)SSR位點(diǎn)及ycf1b、ycf1a、trn S-trn G、trn E-trn T-psb D等10個(gè)高變區(qū)域，可用于百合屬葉綠體基因組分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。

1.2 ? ?轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

針對(duì)于不同的研究目的，目前已有不少關(guān)于百合屬轉(zhuǎn)錄組學(xué)的報(bào)道。作為深入開(kāi)發(fā)百合SSR標(biāo)記的重要方法和分析百合屬植物進(jìn)化歷程的重要工具，最初是Shahin等[3]開(kāi)展了百合屬及郁金香屬的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)113個(gè)共有的SNP及292個(gè)EST-SSRs。隨后研究者通過(guò)岷江百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記，鑒定出1 716個(gè)SSR位點(diǎn)，并對(duì)其中的494個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證[11]。Du等[12]通過(guò)對(duì)百合索爾邦6個(gè)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘出1 853個(gè)SSRs，并在32個(gè)百合基因型中進(jìn)一步鑒定57個(gè)EST-SSR，其中有30個(gè)為功能已知基因。Biswas等[13]也同樣利用轉(zhuǎn)錄組的SSR信息來(lái)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記。

除了分子標(biāo)記挖掘，轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要還應(yīng)用于花粉管發(fā)育[14]、花色形成[15]、鱗莖發(fā)生[16]和打破休眠[17]等方面。為了研究百合花色形成分子調(diào)控機(jī)制，Yang等[16]對(duì)百合Sorbonne進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組研究，揭示了156個(gè)編碼類黃酮生物合成途徑關(guān)鍵酶的基因，并發(fā)現(xiàn)百合Sorbonne花的顏色形成主要受黃酮類生物合成途徑的控制[15]。利用組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究卷丹鱗莖的形成過(guò)程，發(fā)現(xiàn)卷丹的鱗莖從葉柄基部正面的腋下分生組織處啟動(dòng)，淀粉的合成和積累可能會(huì)促進(jìn)卷丹鱗莖的形成，生長(zhǎng)素可能促進(jìn)鱗莖的生成并進(jìn)一步抑制其形成，細(xì)胞分裂素的高合成和低降解率可能會(huì)導(dǎo)致上部葉腋的形成。Huang等[17]研究了亞洲百合‘Ting ghost春化過(guò)程中的差異基因，利用qRT-PCR初步驗(yàn)證了6個(gè)與春化過(guò)程相關(guān)的基因表達(dá)量，并進(jìn)一步驗(yàn)證了VRN1和VRN2這2個(gè)控制春化的基因。

1.3 ? ?蛋白組學(xué)研究

百合蛋白組學(xué)的研究報(bào)道相對(duì)較少。張 ?潔等[18]利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)分析百合小鱗莖抽薹前后的蛋白組表達(dá)差異，得到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)21個(gè)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在百合抽薹過(guò)程中，主要是參與能量代謝、分子伴侶及脅迫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量受到調(diào)控，主要為抽薹過(guò)程準(zhǔn)備能量，重新合成儲(chǔ)能物質(zhì)，并應(yīng)對(duì)低溫春化的生理反應(yīng)。張藝萍等[19]以百合抗病和感病無(wú)性系為試驗(yàn)材料，開(kāi)展了百合抗尖孢鐮刀菌枯萎病的蛋白組學(xué)研究，鑒定得到25個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中10個(gè)為未知功能的蛋白，其余15個(gè)可分為防御反應(yīng)、光合作用、糖類及能量代謝相關(guān)蛋白和熱激蛋白4類。

2 ? ?百合分子標(biāo)記和遺傳多樣性分析

分子標(biāo)記是研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位或由于存在長(zhǎng)短與排列不一的重復(fù)序列等機(jī)制而產(chǎn)生多態(tài)性的技術(shù)。與傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有信息量大、不易受外界環(huán)境影響、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于遺傳多樣性分析、資源評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建及種間親緣關(guān)系等方面[20]。目前，已在百合中應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）等技術(shù)（表1）。

最早是Lee等[21]利用RAPD技術(shù)對(duì)韓國(guó)的百合進(jìn)行了分組。隨后Yamagishi等[22]和Persson等[23]采用RAPD標(biāo)記分析了百合屬植物的種和種間雜種及歐洲百合種群間遺傳變異及群體間親緣關(guān)系。對(duì)青島百合復(fù)合種群中6個(gè)局部種群的遺傳多樣性開(kāi)展了RAPD分析后，發(fā)現(xiàn)其多樣性指標(biāo)與樣地的基本情況具有較強(qiáng)的相關(guān)性[24]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)RAPD也可用來(lái)區(qū)分百合栽培品種和野生種[25]。

在百合遺傳多樣性研究中運(yùn)用較多的另一種分子標(biāo)記為ISSR。Guo等[26]通過(guò)ISSR分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)特征分析，發(fā)現(xiàn)青島百合具有較高的遺傳多樣性，其形態(tài)學(xué)特征和遺傳參數(shù)之間也存在較高的相關(guān)性。研究人員通過(guò)表型性狀、花粉形態(tài)和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)共同分析遺傳多樣性和百合種間的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)野生百合的遺傳多樣性高于栽培種[27]。肖 ?偉等[28]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)7個(gè)百合雜種系96個(gè)品種之間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，最終將這7個(gè)百合雜種系分為兩大類。

其他的百合分子標(biāo)記（AFLP、SSR和SRAP）報(bào)道較少。最初，Heusden等[29]運(yùn)用AFLP建立了亞洲百合的連鎖圖，同時(shí)結(jié)合了BSA方法對(duì)百合抗Fusarium及抗TBV的基因進(jìn)行了QTLs定位?？沦t鋒等[30]和雷家軍等[31]分別建立并優(yōu)化了野百合和卷丹百合的AFLP反應(yīng)體系，有利于開(kāi)展遺傳多樣性的研究。相對(duì)而言，百合SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)較晚。楊素麗等[32]基于EST信息建立了百合SSR標(biāo)記。徐雷鋒等[33]利用20對(duì)SSR引物檢測(cè)到69個(gè)SSR等位位點(diǎn)和170個(gè)帶型，平均每對(duì)引物擴(kuò)增3.45個(gè)等位位點(diǎn)、8.50個(gè)帶型。目前，利用SRAP分子標(biāo)記僅對(duì)百合部分種及品種進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性研究[34]。

在遺傳多樣性研究中，也有涉及2種分子標(biāo)記技術(shù)的研究。Yamagishi等[35]通過(guò)對(duì)亞洲百合進(jìn)行RAPD和ISSR分析，多次試驗(yàn)后均獲得相同的指紋圖譜，表明這2種分析方法都具有較高的穩(wěn)定性。Arzate-Fern等[36]利用ISSR和cpDNA RFLP標(biāo)記對(duì)日本境內(nèi)的瀕危植物L(fēng). maculatum Thunb. var.bukosanense的2個(gè)群體進(jìn)行了遺傳距離的計(jì)算，結(jié)果顯示這2個(gè)群體遺傳距離接近。迄今為止，大量的分子標(biāo)記應(yīng)用于百合的遺傳多樣性研究中，但其分子標(biāo)記的高效利用受到了百合未知基因組的制約。

3 ? ?百合遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建

百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建目前采用的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電激法和花粉管通道法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是指將目的基因插入經(jīng)改造的T-DNA區(qū)，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染植物傷口，從而實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合。由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，限制了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在百合屬植物上的應(yīng)用。最初是Cohen等[37]將根癌農(nóng)桿菌與鱗塊切段共培養(yǎng)后，在愈傷組織中檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。Langeveld等[38]在1995年通過(guò)將百合“Harmony”試管苗莖尖和農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)首次證明單子葉百合屬也可以成為農(nóng)桿菌的寄主。直到2003年Mercuri等[39]首次利用根癌農(nóng)桿菌LBA4404將Rol基因轉(zhuǎn)至長(zhǎng)花百合愈傷組織，成功培育出轉(zhuǎn)基因百合，轉(zhuǎn)化率約為0.5%。田菲菲等[40]將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACO-RNAi載體轉(zhuǎn)化至百合的胚性愈傷，通過(guò)優(yōu)化超聲波等轉(zhuǎn)化條件，瞬時(shí)表達(dá)率和穩(wěn)定表達(dá)率最高可達(dá)到88.90%和27.33%。雖然可以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但遺傳轉(zhuǎn)化效率低，制約了百合轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展。

基因槍法是指利用高壓將帶有目的基因的微小金?；蜴u粒高速射入受體細(xì)胞，使目的基因進(jìn)入細(xì)胞并整合到染色體組。Nishihara等[41]利用基因槍法將GUS基因?qū)氚俸匣ǚ郏⑼ㄟ^(guò)組織化學(xué)染色法檢測(cè)到GUS的瞬時(shí)表達(dá)。Van der Leedge-Plegt等[42]用基因槍法將NTPⅡ基因?qū)氚俸匣ǚ?，授粉雜交后得到3株陽(yáng)性植株，PCR檢測(cè)顯示外源基因已整合到百合植物中。Irifune等[43]也用該方法將編碼PAT的基因?qū)氚俸削[莖分化出的愈傷組織，并獲得具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因再生植株。師守國(guó)等[44]以蘭州百合鱗片為受體，轉(zhuǎn)入DHAR基因的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到1.5%。

電激法是指利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上穿孔從而促進(jìn)外源DNA進(jìn)入的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。Miyoshi等[45]利用電激法將GUS基因?qū)氚俸系脑|(zhì)體，得到瞬時(shí)表達(dá)。Wu等[46]將GUS和GFP基因直接導(dǎo)入百合，并在鱗片組織中發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)。由于百合原生質(zhì)體的再生體系不完善，鮮有這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。

花粉管通道法是利用花粉作為外源DNA的媒介，直接通過(guò)授粉受精獲得轉(zhuǎn)基因種子。杜捷[47]利用花粉管通道法將其他百合品種的總DNA轉(zhuǎn)至蘭州百合中，發(fā)現(xiàn)滴加的DNA溶液中性，濃度為50 μg/mL時(shí)結(jié)實(shí)率較高。李 雙等[48]選擇常規(guī)授粉后0 h涂抹攜帶外源基因的菌液，獲得種子后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源基因成功整合到百合基因組中。

4 ? ?百合功能基因的克隆和機(jī)理研究

目前，克隆基因的方法主要分為2類，對(duì)新基因的克隆常用插入片段標(biāo)簽法和圖位克隆法;對(duì)已知基因的克隆通常采用同源基因克隆法和篩選文庫(kù)法。百合上克隆的基因一般利用同源基因克隆法或篩選文庫(kù)法獲得，主要包括減數(shù)分裂、花發(fā)育和抗逆性相關(guān)基因。

4.1 ? ?百合減數(shù)分裂相關(guān)基因

減數(shù)分裂是真核生物有性生殖過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不僅可保證生物種染色體數(shù)穩(wěn)定，也可使物種適應(yīng)不同環(huán)境變化時(shí)不斷進(jìn)化。由于麝香百合雄性配子體（小孢子細(xì)胞和花粉粒）親緣性強(qiáng)，花藥內(nèi)孢子細(xì)胞間同步發(fā)育，幾十年來(lái)一直被用來(lái)研究減數(shù)分裂[49]。最早是Kobayashi等[50]從麝香百合中分離出18個(gè)與減數(shù)分裂相關(guān)的cDNA片段。這些片段被命名為L(zhǎng)IM基因，其中LIM15基因與已知基因RecA、RAD57和DMC1/ISC2相似，其產(chǎn)物與百合減數(shù)分裂的染色體聯(lián)會(huì)和重組有關(guān)[51-52]。

2003年，Morohashi等[53]發(fā)現(xiàn)，麝香百合的LISCL基因主要在減數(shù)分裂前期的花藥中表達(dá)，且與減數(shù)分裂相關(guān)基因的啟動(dòng)子活性密切相關(guān)。同年，Morita等[54]在研究轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)座子標(biāo)記系統(tǒng)時(shí)，利用百合減數(shù)分裂基因的啟動(dòng)子LIM10和LIM18指導(dǎo)GUS基因在花藥和體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。Mu等[55]構(gòu)建了百合花粉母細(xì)胞發(fā)育不同階段的花藥EST文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)文庫(kù)中的LimHSP16.45可能作為分子伴侶保護(hù)花粉母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂前期免受極端溫度的影響。

4.2 ? ?百合花發(fā)育相關(guān)基因

4.2.1 ? ?百合花型相關(guān)基因。Tzeng等[56]以麝香百合為材料，通過(guò)同源基因克隆法得到百合的LMADS1基因。百合的LMADS1基因與擬南芥的AP3類基因高度同源，但表達(dá)模式不完全相同，同時(shí)酵母雙雜試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型表明了LMADS1-MADS能與擬南芥的PI蛋白互作形成異源二聚體，使其不能有效調(diào)節(jié)下游基因，推測(cè)LMADS1可能代表B功能基因的一種祖先形式，保留了在百合花瓣和雄蕊發(fā)育中形成同源二聚體的能力。而LMADS1的C端區(qū)域?qū)功能蛋白同源二聚體的形成起著重要的作用[57]。隨后，TZeng等[58-59]以相同的方法在麝香百合中克隆得到LMADS2、LMADS3和LMADS4基因。LMADS2基因主要在胚珠表達(dá)，在柱頭中有微弱表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出提早開(kāi)花，不確定性減少花序，通過(guò)誘導(dǎo)萼片同源轉(zhuǎn)化為心皮狀結(jié)構(gòu)，可觀察到柱頭乳突和胚珠。此外，第二輪花瓣轉(zhuǎn)化為雄蕊狀結(jié)構(gòu)。可見(jiàn)，LMADS2是百合的D功能基因。LMAD3和LMAD4是百合的2個(gè)SEP基因，推測(cè)為E基因，在花分生組織、花芽生長(zhǎng)各個(gè)階段、花器官中都有表達(dá)，其中LMADS4基因還在花序組織和葉片中表達(dá)。

Benedito等[60]通過(guò)篩選麝香百合發(fā)育中花芽的cDNA文庫(kù)，得到LLAG1基因，該基因與單子葉植物的AG基因高度同源，僅在雄蕊和心皮中表達(dá)，構(gòu)成ABC模型的C結(jié)構(gòu)域。吳小萍等[61]克隆得到LLGLO1基因，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，該基因在百合花器官、心皮和莖中均有表達(dá)，且隨著心皮的發(fā)育成熟，其表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加。該基因在百合第一輪花器官中的表達(dá)量變化支持了van Tunen對(duì)ABC模型的修正[62]。隋娟娟等[63]利用RACE法從重瓣百合中克隆得到LiSEP3基因，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贓類基因，主要在花中表達(dá)，在最內(nèi)側(cè)的花瓣中表達(dá)量最高，與雙子葉植物花中SEP3基因的表達(dá)模式不同。

4.2.2 ? ?百合花色相關(guān)基因?；ㄇ嘬帐侵参锓N主要的花色素，查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是花青苷合成途徑的限速酶，目前關(guān)于百合查爾酮合成酶基因的研究報(bào)道較多。Nakatsuka等[64]從亞洲百合中克隆了3個(gè)CHS基因和1個(gè)DFR基因，在花青苷著色的部位有表達(dá)，表明這幾個(gè)基因都參與了花青苷的生成。楊 ?麗等[65]從東方百合中分離到1個(gè)查爾酮合成酶基因，命名為Ychs-1?；加耓66]為了研究百合查爾酮合成酶基因（LCHS2）對(duì)花色的調(diào)控影響，利用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)化矮牽牛，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)了鑲嵌型、馬賽克型和中間型這3種花色類別，并且花青苷的含量也降低了。

Yamagishi等[67]從亞洲百合上分離到2個(gè)與花青苷合成相關(guān)的基因——LhMYB6和LhMYB12，研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因可與LhbHLH2蛋白相互作用，通過(guò)共同表達(dá)來(lái)激活花青苷合成基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)在百合鱗莖上過(guò)表達(dá)也表明LhMYB6和LhMYB12基因正調(diào)控花青苷的生物合成，并決定了花青苷在器官和組織中的特異性積累。

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