張浩然 張亦菲 徐 汀 田 愷 華賢輝 黃家鶯*

（上海市獸藥飼料檢測所，上海201103）

美洛昔康屬于烯醇酰胺類非甾體抗炎藥，最早由勃林格殷格翰公司研制[1]。研究表明，美洛昔康對環(huán)氧化酶-2（COX-2）有選擇性抑制作用，解熱鎮(zhèn)痛及抗炎性作用較高，對胃腸道、腎臟副作用較低[2]，主要用于風濕關節(jié)炎[3]、骨關節(jié)炎的治療[4]及術后止痛[5]。目前，對于美洛昔康的測定，主要有電化學法[6]和紫外分光光度法[7]，這兩種方法雖有一定的準確性，但難以適應大批量檢測。而液相色譜法較多報道于血清中美洛昔康的檢測[8-9]，且條件繁瑣。本文根據注射液的特點，建立了高效液相色譜法測定美洛昔康注射液中美洛昔康的含量，該方法簡單快速，具有良好的精密度和準確度，能夠滿足質量控制需求。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1100，安捷倫科技有限公司，Waters e2695，沃特世公司；電子天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒- 托利多儀器（上海）有限公司；純水機：Molatom 1810A，中國重慶摩爾水處理設備有限公司。

1.2 試藥

美洛昔康對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100679-201102，含量99.9%）；實驗用水（電阻率>18 MΩ·cm，符合GB/T6682 一級用水的規(guī)定）；醋酸銨（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；美洛昔康注射液（魯舍里樂藥業(yè)有限公司提供，批號1801001、1801002 及1805003）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用ODSC18色譜柱（柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm），以甲醇-0.lmol/L 醋酸銨溶液（1:1）為流動相流動相；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為270 nm。典型色譜圖見圖1。

圖1 美洛昔康對照品的典型色譜圖

表1 準確度試驗結果（n=9）

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備。精密量取本品適量，于容量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1ml 中約含美洛昔康0.1mg 的溶液，搖勻，經0.22 μm 濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備溶液的制備。取美洛昔康對照品50 mg，置50 mL 量瓶中，加1 mol/L 氫氧化鈉溶液4 mL，充分振搖3分鐘，加甲醇30 mL，渦旋3 分鐘，超聲處理10 分鐘，放冷。用50%甲醇溶液（V1∶V2）稀至刻度，搖勻，得到對照品儲備溶液。

2.2.3 對照品工作溶液。精密量取1 mL 對照品儲備溶液置10 mL 容量瓶中，加流動相定量稀釋制成每1ml 中約含美洛昔康0.1mg 的溶液，搖勻，經0.22 μm 濾膜濾過，濾液作為對照品工作溶液。

2.3 供試品的測定

按照2.1 的色譜條件及2.2 的溶液制備方法，將供試品溶液和對照品工作溶液注入高效液相色譜儀，按外標法以峰面積計算，即得美洛昔康的含量。

2.4 線性關系考察

美洛昔康對照品儲備液經精密稀釋，制備60、80、100、120、160 μg/mL 的美洛昔康對照品系列溶液，每個濃度點重復5 次進樣，按照2.1 的色譜條件進行測定。以美洛昔康對照品濃度為橫坐標（x），以相應濃度測得的峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。得到方程為y=31361x+31140，相關系數(shù)為0.9999。說明美洛昔康濃度在60～160 μg/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 準確度試驗

隨機選取樣品，按照對照品添加量與待測成分量之比為0.8:1, 1:1, 1.2:1 進行低、中、高三種不同濃度的準確度試驗，每個濃度3 份平行，按照2.1 的色譜條件及2.2 的制備方法進行測定。平均回收率為97.4%，RSD 為0.9%，結果見表1。

2.6 重復性試驗

按照2.1 的色譜條件及2.2 的制備方法，對各批次樣品重復進樣6次，并記錄峰面積，進行重復性試驗。結果表明（表2），各批次樣品的RSD為0.23%～0.25%，重復性較好。

2.7 中間精密度試驗

在不同時間，由不同的實驗人員用不同的儀器對相同樣品進行中間精密度試驗。條件A：實驗員甲，使用Agilent 1100 高效液相色譜儀，配Shiseido MG 色譜柱（C18，柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm）；條件B：實驗員乙，使用Waters e2695 高效液相色譜儀，配Waters Symmetry 色譜柱（C18，柱長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑5 μm）。選擇各批次樣品，按照上述A、B 不同條件進行試驗。結果表明（表3），RSD 為0.19%～0.62%，中間精密度較好。

2.8 耐用性試驗

選取1801003 批次樣品，按照2.1的色譜條件及2.2 的制備方法配置3份平行樣品，進行耐用性試驗，考察流速及柱溫對含量測定的影響。結果表明（見表4），流速在0.8～1.2 范圍內對含量測定結果無影響；柱溫在35℃～45℃范圍內對含量測定結果無影響。

2.9 供試品測定

采用本法，對供試品的含量進行測定，并與生產企業(yè)提供的數(shù)據進行比較，結果見表5。結果表明，本方法測定美洛昔康注射液含量結果與生產企業(yè)提供的檢測結果基本一致。

3 討論與結論

3.1 檢測波長的確定

將美洛昔康對照品儲備液用流動相稀釋10 倍后，利用二極管陣列檢測器在190 nm～400 nm 范圍內對美洛昔康進行了紫外波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在270 nm 處有最大吸收，故確定270 nm為美洛昔康含量測定的檢測波長。

3.2 對照品的預處理

據報道，二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康對照品[10]。二甲基甲酰胺作為助溶劑，對改善色譜峰型，平穩(wěn)基線有一定作用，但長期使用會引起許多問題。首先，二甲基甲酰胺可引起人體消化道紊亂，肝臟和腎臟損害，長期接觸，會損害試驗人員的身體健康[11]。其次，二甲基甲酰胺作為一種特殊的溶劑，會對色譜柱造成損傷[12]，進而降低色譜柱的柱效及理論塔板數(shù)，不利于檢測任務的長期重復進行。本文采用甲醇超聲助溶，并用50%甲醇定容稀釋，對美洛昔康的溶解效果好。在保證方法穩(wěn)定可靠的同時，將試驗對人員健康和色譜柱的潛在危害降至最低。

表2 重復性試驗數(shù)據表（n=6）

表3 中間精密度試驗數(shù)據表（n=12）

表4 耐用性試驗數(shù)據表（n=3）

本方法簡便快捷，具有較好的準確度及精密度，能夠滿足對美洛昔康注射液質量控制的需求。

表5 含量測定試驗數(shù)據表（n=3）

% % 1801001 1801002 1801003 106.30.18100.60.15106.00.27106.60.16100.40.19105.70.23-0.30.20.3

[8]譚力,張杰,楊麗莉,凌樹森,熊守軍.美洛昔康血藥濃度高效液相色譜法測定及生物等效性研究[J].中國藥科大學學報,2000(4):31-34.

[9]李英,王高峰,武銀芳,龍麗紅.人血漿中美洛昔康的高效液相色譜測定法[J].藥物分析雜志,2001(1):33-36.

[10]賈寶秀,曹明亮,李珂等.HPLC 法測定美洛昔康膠囊的含量[J].泰山醫(yī)學院學報,2006(2):97-98.

[11]田丙正,張敏,張付海等.液相色譜法測定工業(yè)廢水中N,N-二甲基甲酰胺[J].工業(yè)水處理,2018,38(2):89-91.

[12]劉翻,熊志超,張凌怡等.高效液相色譜柱清洗與再生方法[J].分析測試技術與儀器,2010,16(2):71-77.