云嶺牛無角性狀的分子鑒定與應(yīng)用

李 常， 王 寧， 劉玉香， 亐開興， 張繼才， 黃必志， 雷初朝

(1.陜西省佳縣畜牧技術(shù)推廣站，陜西 佳縣 719200；2.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，昆明 650212；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

牛角性狀是由基因控制的，White等[1]通過研究發(fā)現(xiàn)牛無角對(duì)有角是顯性。Medugorac等[2]通過對(duì)歐洲1 675頭不同普通牛品種的有角與無角性狀進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)202 bp片段的插入缺失(P202ID)導(dǎo)致歐洲普通牛表現(xiàn)為無角性狀，該插入缺失位于1號(hào)染色體的IFNAR2和OLIG1基因之間，不改變編碼序列或剪接位點(diǎn)。在荷斯坦牛中存在260 kb單倍型與其無角性狀密切相關(guān)，該260 kb單倍型包含5個(gè)完全連鎖的突變位點(diǎn)(P5ID、PG1654405A、PC1655463T、PC1768587A和P80kbID)。P5ID突變由12 bp序列(ttctcagaatag)更換為7 bp序列(cgcatca)，從而導(dǎo)致無角荷斯坦牛中該序列多了5 bp堿基序列；P80kbID表示80 kb重復(fù)序列位于純合無角荷斯坦牛染色體的末端區(qū)域；還有3個(gè)SNPs分別位于第1 654 405(G→A)，1 655 463(C→T)和1 768 587(C→A)位。這5個(gè)突變位點(diǎn)為荷斯坦奶牛無角性狀所特有。因此，攜帶1個(gè)或2個(gè)拷貝的P202ID等位基因的牛表現(xiàn)為無角，其基因型分別為Pp或者PP。牛有角性狀由prs基因控制，無角性狀由PC和PF基因控制。PF、PC、prs是3個(gè)復(fù)等位基因；而PF、PC是2個(gè)等顯性復(fù)等位基因。PC和PF基因是根據(jù)無角牛起源的地區(qū)來命名的：起源于凱爾特地區(qū)的無角牛攜帶的單倍型P202ID用PC表示，而起源于荷斯坦地區(qū)的無角牛攜帶的5個(gè)完全連鎖的突變位點(diǎn)用PF表示。因此，無角牛包括純合無角PF/PF、PC/PC和PC/PF3種基因型，雜合無角PC/prs、PF/prs2種基因型，而有角牛只有prs/prs一種基因型。因此，理論上來講，基于這6個(gè)無角突變位點(diǎn)就能鑒定該牛是無角牛還是有角牛。本研究旨在檢測(cè)云嶺牛種公牛和核心群母牛的有角與無角性狀，所選云嶺牛血統(tǒng)純正，無荷斯坦奶牛血統(tǒng)。因此，通過PCR擴(kuò)增方法對(duì)P202ID位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，理論上可以有效鑒定云嶺牛的有角與無角性狀及其相應(yīng)的基因型，為云嶺牛無角品系的選育提供分子遺傳學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)自小哨示范牧場(chǎng)云嶺牛核心育種場(chǎng)采集263頭云嶺牛(250頭無角云嶺牛、13頭有角云嶺牛)耳組織樣本，-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增測(cè)序

利用酚—氯仿法提取基因組DNA。利用Medugorac等[2]和曾璐嵐等[3]發(fā)表的P202ID引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體積為12.5 μL：2×Reaction Mix 6.25 μL，20 ng/μL DNA模板1.0 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，去離子水4.85 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，34個(gè)循環(huán)(94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以此判斷基因型。

2 結(jié)果與分析

用P202ID引物對(duì)263頭云嶺牛(250頭無角云嶺牛、13頭有角云嶺牛)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示；對(duì)擴(kuò)增片段大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及基因型分析，云嶺牛的有角與無角性狀的分子鑒定結(jié)果如表1。由圖1和表1可以看出，無角云嶺牛又分為純合無角牛和雜合無角牛。純合無角云嶺牛(公牛5頭，母牛44頭)的基因型為PC/PC，只有1條擴(kuò)增帶571 bp，其基因型頻率為18.63%；雜合無角云嶺牛(其中公牛9頭，母牛158頭)的基因型為PC/prs，有2條擴(kuò)增帶，分別為571 bp和369 bp，其基因型頻率為63.50%，無角云嶺?？偟幕蛐皖l率為82.13%。有角云嶺牛(公牛1頭，母牛4頭)為隱性純合子，其基因型為prs/prs，只有1條擴(kuò)增帶369 bp，其頻率為1.90%。以上這221頭云嶺牛的基因型與云嶺牛有角與無角性狀完全一致，分子鑒定的成功率為84.03%。但是，本試驗(yàn)也檢測(cè)到8頭有角云嶺牛(公牛2頭，母牛6頭)為雜合無角?；蛐?PC/prs)，其基因型頻率為3.04%；34頭無角云嶺牛(母牛34頭)為有角基因型(prs/prs)，其基因型頻率為12.93%，總計(jì)有15.97%的分子鑒定結(jié)果與云嶺牛已知的無角與有角性狀不相符。

注：1，3，5，8，10，14泳道基因型為PC/prs；2，9，11，12泳道基因型為Prs/prs；4，6，13泳道基因型為PC/PC；7泳道為空白對(duì)照。

圖1 云嶺牛P202ID引物擴(kuò)增的牛角性狀多態(tài)性

表1 云嶺牛單倍型P202ID的PCR擴(kuò)增片段大小、基因型與基因型頻率

3 討 論

長(zhǎng)期以來，牛的無角表型都是選擇和研究的目標(biāo)。隨著肉牛業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)殖水平越來越高，在現(xiàn)代集約化飼養(yǎng)條件下，牛角不僅沒有什么價(jià)值，還會(huì)對(duì)牛和人造成傷害。另外，牛長(zhǎng)一對(duì)大角就需要消耗一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率下降。因此，培育無角牛成了時(shí)代的需要，這樣做既不違背去角引起的動(dòng)物福利原則，又能提高肉牛的養(yǎng)殖效益。

在本試驗(yàn)中，221頭云嶺牛的基因型與其角的性狀完全對(duì)應(yīng)，成功率為84.03%，遠(yuǎn)低于夏南牛100%成功率[3]。還有15.97%云嶺牛與已知的無角與有角性狀不相符。原因有三點(diǎn)：第一，可能云嶺牛無角與有角性狀的記錄有誤，但錯(cuò)誤率不會(huì)這么高；第二，可能與普通牛特殊的無角與有角性狀的致因突變有關(guān)，例如，蒙古國(guó)牦牛的無角基因來自于無角蒙古牛起源，其無角突變?yōu)閺?fù)雜的P219ID位點(diǎn)[4]；第三，可能與云嶺牛含有瘤牛血統(tǒng)有關(guān)，因?yàn)樵茙X牛是由婆羅門牛、莫累灰牛和云南黃牛采用三元雜交選育而來，婆羅門牛屬于瘤牛。牛無角與有角性狀的致因突變都是在普通牛中鑒定出來的，瘤牛無角與有角的基因突變是否與普通牛一致，尚沒有遺傳學(xué)證據(jù)。盡管Koufariotis等[5]通過對(duì)4頭無角和46頭有角婆羅門牛的全基因組進(jìn)行重測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)3頭為純合無角牛，1頭為雜合無角婆羅門牛，其無角基因與凱爾特突變基因PC一致，為P202ID單倍型，但也不能排除瘤?？赡苡歇?dú)特的無角基因和突變位點(diǎn)。Chen等[6]通過對(duì)48頭無角和16頭有角蜀宣花牛的P202ID、P80kbID和P219ID變異進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)蜀宣花牛存在已知的3種候選突變(P202ID、P80kbID和P219ID)，而P202ID突變占主導(dǎo)地位。但是，他們的研究還發(fā)現(xiàn)1頭無角蜀宣花牛沒有攜帶這3種候選突變中的任何一種，提示還有別的突變影響牛的無角性狀，表明決定牛有角與無角性狀的基因突變可能有多個(gè)基因參與。因此，要完全弄清楚牛無角突變的分子機(jī)制，還需要更多的深入研究。

4 應(yīng) 用

盡管本研究的分子鑒定技術(shù)用于鑒定云嶺牛無角與有角性狀的成功率為84.03%，但并不妨礙本研究的分子鑒定技術(shù)用于云嶺牛無角品系的選育與應(yīng)用。為了加快云嶺牛無角品系的選育速度，最重要的是鑒定無角種公牛為純合基因型PC/PC，其次，鑒定云嶺無角牛核心母牛群也為純合基因型PC/PC，再讓純合無角公牛PC/PC與純合無角母牛PC/PC交配，那么后代全為無角牛。這樣，只要有足夠的純合無角公牛與無角母牛，理論上經(jīng)過一代這樣的選種選配，其后代均為純合無角公牛與母牛，無角牛品系的選育就完成了。因此，利用無角?；虻姆肿予b定技術(shù)，可以大大縮短無角牛品系的選育時(shí)間。盡管黃牛的世代間隔長(zhǎng)，又是單胎動(dòng)物，只要嚴(yán)格利用經(jīng)過分子鑒定的純合無角公牛與母牛進(jìn)行選種選配，完全可以在5～10年內(nèi)選育出云嶺牛無角新品系。