郭鳳茹 劉元雪 施文正 寧喜斌 李曉暉*（ 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海20306 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 上海20306 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海）上海20306）

乳酸菌是一類能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏染色陽性的細(xì)菌。 目前報道的產(chǎn)乳酸細(xì)菌包括乳桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬等43 個屬[1]。乳酸菌最早分離自酸牛乳中[2]，其后在發(fā)酵肉制品、乳制品、泡菜、發(fā)酵谷物等產(chǎn)品中得到廣泛的研究和利用[3-6]。 乳酸菌在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用主要有兩個方面：一是發(fā)酵微生物，在發(fā)酵制作乳制品、肉制品、泡菜的過程中起著關(guān)鍵的作用，另一方面是作為益生菌，定植于動物腸道中，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群，增強免疫，抑制腸道內(nèi)特異性病原菌的生長繁殖及毒素的產(chǎn)生等益生功能[7-8]。乳酸菌作為魚類腸道的益生菌，在其養(yǎng)殖過程中也發(fā)揮重要作用。 乳酸菌可以調(diào)節(jié)魚類腸道菌群平衡，提高飼料的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化率，加速魚類生長。

隨著抗生素的廣泛使用， 越來越多的細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，且耐藥水平也不斷提高，抗生素耐藥性已經(jīng)成為一個全球化問題[9]。 20 世紀(jì)80年代國外學(xué)者研究了乳酸菌的藥敏性[10-11]，發(fā)現(xiàn)它們對抗生素有耐藥現(xiàn)象。長期以來，國內(nèi)外科研人員主要集中于臨床致病菌的耐藥性研究， 而對非致病菌和益生菌耐藥性的研究報道較少[12]。 乳酸菌作為一種益生菌，它的耐藥性有積極的意義。當(dāng)人或動物服用抗生素時， 往往會把腸道中有益和有害的細(xì)菌同時殺滅，引起腹瀉，如果乳酸菌對抗生素有抗性，就可以緩解這種不良反應(yīng)，幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡[13-14]。然而，有研究表明，在體外培養(yǎng)條件下耐藥基因能在不同種屬的乳酸菌菌株中發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。 這說明對于進入人體和動物的外源性活菌在腸道內(nèi)生長、定植、繁殖，其耐藥基因能以各種方式在腸道菌群間相互傳遞， 從而導(dǎo)致致病菌獲得耐藥性，危害宿主健康[16]。

本研究采用紙片擴散法對分離自羅非魚腸道的乳酸菌對13 種抗生素（青霉素、氨芐西林、紅霉素、 卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、萬古霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星）的藥敏性進行檢測和分析，為分離得到的乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)實踐及水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株為本實驗室保存的分離自羅非魚腸道的乳酸菌，共42 株乳酸菌。 其中乳桿菌屬（Lactobacillus）32 株，乳球菌屬（Lactococcus）5 株，腸球菌屬（Enterococcus）5 株，菌株的分離鑒定結(jié)果可參考另一篇文章[17]。 如表1 所示，采用大腸桿菌（E. coli）ATCC 35218 和金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 25923 作為質(zhì)控菌株。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 含實驗抗生素的13 種藥敏紙片，分別為青霉素（Penicillin，PEN）、氨芐西林（Ampicillin，AMP）、 紅霉素（Erythromycin，ERY）、卡那霉素 （Kanamycin，KAN）、 鏈霉素（Streptomycin，STR）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、四環(huán)素（Tetracycline，TET）、 多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）、 萬古霉素 （Vancomycin，VAN）、 氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、 諾氟沙星 （Norfloxacin，NOR）、 氧氟沙星（Ofloxacin，OFL），購于杭州微生物試劑有限公司。紙片直徑為6 mm，符合抗生素紙片標(biāo)準(zhǔn)。 MRS 培養(yǎng)基、TPY 培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

表1 供試菌株16S rRNA 序列鑒定結(jié)果Table 1 Species identification of the test strains by 16S rRNA sequence analysis

1.2 方法

將乳桿菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬供試菌株分別采用相應(yīng)的MRS、TPY、M17 液體培養(yǎng)基活化。 經(jīng)轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)，每隔1 h 取樣測定，使得到菌液的濃度為（3.0×108～8.0×108）CFU/mL。在9 cm 培養(yǎng)皿中分別倒入10 mL MRS、TPY、M17 瓊脂培養(yǎng)基， 取200 μL 活化菌液與5 mL 45 ℃0.6%的相應(yīng)軟瓊脂混勻 （此時菌液的濃度保持在1.5×107CFU/mL～3.0×107CFU/mL）， 將軟瓊脂均勻地鋪在預(yù)先制備好的同種固體培養(yǎng)基上， 于室溫下放置大約15 min，待上層瓊脂冷卻凝固后，將含有抗生素的藥敏紙片通過無菌操作貼放在瓊脂表面，每種藥敏紙片3 個平行，4 ℃擴散3 h 后于37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量產(chǎn)生的抑菌圈直徑，取3次測量的平均值作為結(jié)果。 質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 35218 和金黃色葡萄球菌ATCC25923 的培養(yǎng)和保藏分別用營養(yǎng)肉湯和TSB 培養(yǎng)基， 用與上相同的方法測定。 依照CHARTERIS W P[18]對乳桿菌和乳球菌[19]的抗生素藥敏標(biāo)準(zhǔn)（表2），判斷乳酸菌對常用抗生素的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控菌株對抗生素的藥敏實驗結(jié)果

質(zhì)控菌株大腸桿菌（ATCC 35218）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）的耐藥性實驗結(jié)果如圖1所示，抑菌圈直徑如表3 所示。 由圖1 可知，質(zhì)控菌株在藥敏紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，近乎圓形，可用于直徑的測量。 表3 的結(jié)果顯示，質(zhì)控菌株對實驗抗生素的抑菌圈直徑均在允許范圍內(nèi)（敏感），說明本試驗方法可行，且藥敏紙片有效，可進行乳酸菌對實驗抗生素的藥物敏感性研究。

圖1 大腸桿菌對部分抗生素的藥敏實驗Fig.1 The susceptibility experiment of E.coli to some antibiotics

表2 抗生素抗性的判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standards for judgment antibiotic resistance

表3 質(zhì)控菌株的耐藥性Table 3 Antibiotic resistance of reference strain

2.2 待測菌株對實驗抗生素的藥敏實驗結(jié)果

2.2.1 乳桿菌屬乳酸菌 由表4 可知， 兩種乳桿菌主要對KAN、GEN、VAN、CIP、NOR、OFL 表現(xiàn)出耐藥性，其中對KAN、VAN、CIP 和NOR 的耐藥性最強，高達80%以上；兩種乳桿菌均表現(xiàn)多重耐藥性，但對四環(huán)素類抗生素敏感。戊糖乳桿菌的3 株菌 對PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR的耐藥菌株數(shù)達100%，而這些抗生素均為養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的抗生素種類，因此，這3 株菌有望應(yīng)用于魚類的生產(chǎn)，但其是否含有耐藥基因以及相關(guān)的轉(zhuǎn)座子，能否轉(zhuǎn)移給腸道其它菌群，進而影響腸道健康，還需做基因的分型研究。植物乳桿菌的29 株菌對抗生素的耐藥性種內(nèi)差異較大，這可能和采樣時間、采樣時菌株所處環(huán)境、溫度和食性等有關(guān)；但50%以上的菌株為KAN-GEN-VAN-CIP-NOR-OFL多重耐藥，對抗生素敏感的菌株占比較小。

表4 乳桿菌屬乳酸菌對抗生素的抗性Table 4 Antibiotic resistant patterns of the Lactobacillus

2.2.2 乳球菌屬乳酸菌 由表5 可知， 棉籽糖乳球菌的藥敏性遺傳穩(wěn)定，5 株菌之間的藥敏性有一定的差異，其中對PEN（80%）和STR（60%）耐藥， 對其它抗生素較敏感， 對VAN、CIP、NOR 和OFL 的敏感性達100%。

表5 乳球菌屬乳酸菌對抗生素的抗性Table 5 Antibiotic resistant patterns of the Lactococcus

2.2.3 腸球菌屬乳酸菌 表6 表明腸球菌屬乳酸菌對實驗抗生素的耐藥性種間差異明顯， 但對PEN、AMP、VAN、CIP、OFL 敏感，敏感菌株數(shù)分別達80%，100%，80%，80%和80%； 對ERY 中度敏感；而對其余抗生素則大多表現(xiàn)耐藥。意大利腸球菌的2 株菌對AMP、ERY、GEN 均耐藥，對TET 敏感，但對其余抗生素的藥敏性不同，但本試驗僅分離2 株菌，其結(jié)果不具代表性，不能說明意大利腸球菌對抗生素藥敏性的平均水平。 鉛黃腸球菌對PEN、AMP、CIP、VAN 和OFL 敏感（100%），對ERY中度敏感（100%），對其它抗生素耐藥，菌株耐藥性的差異可能來自于菌株本身生理特征和耐藥基因的差異。

表6 腸球菌屬乳酸菌對抗生素的抗性Table 6 Antibiotic resistant patterns of the Enterococcus

3 討論

本研究中， 菌株LPN05 對13 種抗生素都有抗性， 是耐藥普最廣的菌株， 其次是LPN04、LPN01 對11種抗生素都有抗性，LPN02、LPN03對10 種抗生素有抗性。 由表7 統(tǒng)計結(jié)果顯示，42株乳酸菌主要對PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR和OFL 耐藥， 耐藥菌株數(shù)分別為19 （45.2%），31（73.8%），24（57.1%），34（81.0%），30（71.4%），34（81.0%）和20（47.6%）。 羅非魚腸道乳酸菌對13種常見抗生素的藥物敏感性測試以及不同屬乳酸菌對抗生素的耐藥分析結(jié)果表明， 不同屬乳酸菌對抗生素的耐藥性表現(xiàn)出較明顯的種間差異，而相同屬的乳酸菌有其遺傳耐藥性， 也存在不同程度的種內(nèi)差異。 不同屬乳酸菌的耐藥譜呈現(xiàn)較大不同：乳球菌屬主要表現(xiàn)對氨基糖苷類的耐藥性；腸球菌屬對氨基糖肽類和氟喹諾酮類耐藥； 而乳桿菌屬對氨基糖苷類、糖肽類和氟喹諾酮類耐藥，對四環(huán)素類抗生素敏感。 乳酸桿菌對抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素敏感，如四環(huán)素類抗生素[20-21]，與本試驗結(jié)果一致。而大多數(shù)乳酸桿菌對VAN 具有高水平的抗性[22]。Hamilton-Miller 等[23]報道了嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌對VAN 有天然抗性，與本試驗乳桿菌對VAN 的耐藥性一致， 乳酸桿菌對VAN的抗性是由于它們在肽聚糖中具有D-Al-D-Lactate 而不是D-Ala-DAla 二肽[24]。而Franz 等[25]發(fā)現(xiàn)分離自發(fā)酵乳中的腸球菌屬（主要是糞腸球菌和屎腸球菌）對VAN 敏感；而本試驗中腸球菌屬對VAN 耐藥株為50%， 主要對AMP 敏感， 這與Lopes 等[26]的研究結(jié)果一致。 大多數(shù)乳球菌對氨基糖苷類抗生素具有抗性[27]，而本試驗中乳球菌只對GEN 表現(xiàn)出了較高的耐藥性。 這表明，乳酸菌對抗生素的耐藥性可能和來源密切相關(guān)， 例如取樣環(huán)境、培養(yǎng)條件[28-29]等都會影響敏感性測定的結(jié)果。

表7 乳酸菌對13 種抗生素的抗性統(tǒng)計Table 7 Data of susceptibility to 13 kinds of antibiotics of lactic acid bacteria

本研究采用分離自羅非魚腸道的42 株乳酸菌（分別屬于5 個菌種）作為供試菌株，測試它們對13 種抗生素的藥敏性。 研究結(jié)果表明42 株乳酸菌都有一定的耐藥性，主要對PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR 和OFL 耐藥， 耐藥菌株數(shù)分別為19（45.2%），31（73.8%），24（57.1%），34（81.0%），30（71.4%），34（81.0%）和20（47.6%），菌株的耐藥性有一定的種間和種內(nèi)差異， 部分菌株有多重耐藥性。 本試驗結(jié)果反映了羅非魚腸道乳酸菌的耐藥性情況， 為魚類腸道乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)實踐以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的合理使用提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。