謝芝玲，徐佳瑩，潘 登，劉 峰，陳 燕，楊煥勝，印遇龍,4，夏立秋，張友明,，涂 強(qiáng)*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長沙 410081； 2.亥姆霍茲抗感染國際實(shí)驗(yàn)室， 山東大學(xué)亥姆霍茲生物技術(shù)研究所， 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島 266237； 3.山東億安生物工程有限公司， 濟(jì)南 250100； 4.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室， 亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南省健康畜禽工程研究中心， 農(nóng)業(yè)部中南部動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)科學(xué)觀測站， 長沙 410125)

水產(chǎn)養(yǎng)殖是農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分[1,2]，其大多采用高密度養(yǎng)殖的方式實(shí)施。在水產(chǎn)養(yǎng)殖的過程中，飼料殘?jiān)⑺鷦?dòng)物的排泄物以及動(dòng)植物尸體會(huì)不斷地在養(yǎng)殖水體中堆積，在缺氧的條件下，經(jīng)淤泥中的微生物發(fā)酵分解產(chǎn)生氨氮、硫化物、有機(jī)酸和亞硝酸鹽等多種有害物質(zhì)，引起水體嚴(yán)重污染[3,4]。同時(shí)，污染的水體環(huán)境使得原有的生態(tài)系統(tǒng)平衡被打破[5]，水體中的浮游植物以及水生植物無法正常生長，給各種有害病源微生物的繁殖和傳播創(chuàng)造了有利條件，導(dǎo)致水生產(chǎn)品的患病率增高，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和健康發(fā)展。

以往經(jīng)常使用各類化學(xué)藥物以及抗生素來抑制病原微生物的生長繁殖[6]。然而，抗生素的大量使用容易引起內(nèi)源性感染、耐藥性菌株的產(chǎn)生、水產(chǎn)品免疫力低下和水產(chǎn)品以及水體環(huán)境中抗生素殘留[7]等問題，危及食品衛(wèi)生安全甚至人類健康。目前，許多國家和地區(qū)都已經(jīng)明令禁止在飼喂端使用促生長類的抗生素，所以急需要一種綠色健康的技術(shù)來推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

針對近年來對蝦養(yǎng)殖低產(chǎn)、病多的難題，有效的微生物菌劑在這樣的市場需求下應(yīng)運(yùn)而生[8]。大量試驗(yàn)證明，微生物菌劑是抗生素的最佳替代品之一，其具有安全可靠、無毒害作用和不污染環(huán)境[9-11]等優(yōu)點(diǎn)。為此，本研究以長毛對蝦(Penaeuspenicillatus)為研究對象，監(jiān)測并比較了添加復(fù)合微生物菌劑后，對蝦的生長情況和養(yǎng)殖環(huán)境中相關(guān)指標(biāo)的變化情況，以探討微生物制劑對于對蝦養(yǎng)殖及養(yǎng)殖水體改良的影響情況及使用方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

長毛對蝦購自廈門水產(chǎn)學(xué)院海水育苗場，復(fù)合微生物菌劑由山東億安生物工程有限公司提供，原料為復(fù)合微生物菌粉25%、低聚異麥芽糖4.85%、菜籽餅粉70%、食用香精0.15%，活菌數(shù)為1010CFU/g。其中復(fù)合微生物菌粉為酵母菌[產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)]，乳酸菌[嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、德氏乳酸桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)]，芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和光合菌(photosynthetic bacteria)的組合，其質(zhì)量比為1∶1∶1∶0.5?；A(chǔ)飼料原料為低聚異麥芽糖6.22%，菜籽粉餅93.33%，食用香精0.2%。

試驗(yàn)設(shè)備主要有電子磅秤AWH(上海英展公司)、分析天平型號(hào)FA1004N(上海精密儀器儀表有限公司)、分光光度計(jì)型號(hào)721G(上海儀電分析儀器有限公司)、pH計(jì)PHS-3C(上海儀電分析儀器有限公司)和水質(zhì)檢測儀XZ-0178(青島明博環(huán)保科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)為單因子試驗(yàn)，試驗(yàn)場地位于山東省淡水水產(chǎn)研究所。將平均體長為0.5 cm的396尾對蝦隨機(jī)分成4個(gè)組，分別為對照組組1，試驗(yàn)組組2、組3和組4，每個(gè)組設(shè)定3個(gè)平行，每個(gè)平行33尾，分別養(yǎng)殖于1.2 m×1.0 m×0.6 m的室內(nèi)水泥池，進(jìn)行為期33 d的飼養(yǎng)(2018年5月23日至2018年6月24日)。對照組組1投喂無復(fù)合微生物菌劑的基礎(chǔ)飼料；組2、組3和組4為試驗(yàn)組，投喂有微生物菌劑添加的飼料，微生物菌劑分別占飼料質(zhì)量的1.0%、1.5%和2.0%。每天投餌2次，分別在上午7∶00和下午18∶00。

在投放蝦苗前15 d，每畝蝦池用25 kg經(jīng)過0.5%的億安奇樂發(fā)酵的復(fù)合菌液水均勻噴灑蝦池，凈化養(yǎng)殖環(huán)境，為不同組的對蝦提供相同的初始養(yǎng)殖環(huán)境。

1.3 樣品采集

在測量日的當(dāng)天7∶30至8∶00，在距離蝦池岸0.6 m、水深0～10 cm處的4個(gè)采樣點(diǎn)用采泥器取樣，樣品裝進(jìn)高溫高壓滅菌后的塑料管內(nèi)密封冷凍保存。在測量日的當(dāng)天7∶30至8∶00，用采水器在距離蝦池岸0.6 m、水深20～30 cm處的4個(gè)采樣點(diǎn)采取水樣，通過微孔濾膜抽真空過濾，濾液密封保存。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

生產(chǎn)性能測定：在測量日當(dāng)天，從4個(gè)組中分別隨機(jī)抽取30尾(各平行組10尾)對蝦進(jìn)行測量、稱重，分別計(jì)算4個(gè)組對蝦的健康及死亡情況。

水質(zhì)指標(biāo)測定：pH值用pH計(jì)現(xiàn)場測定，溶解氧(dissolved oxygen,DO)用水質(zhì)檢測儀現(xiàn)場測定，水質(zhì)分析按照GB17378.4-2007方案進(jìn)行[12]，氨氮(NH4-N)含量測定采用次溴酸鹽氧化法，亞硝酸氮(NO2-N)含量采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定，硝酸氮(NO3-N)含量測定采用鋅-鎘還原法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所獲數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL表格初步處理作圖，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)結(jié)果平均數(shù)的顯著性，P<0.050表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對長毛對蝦的生產(chǎn)性能的影響

從表1可以看出，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，幼蝦的體長和體重與養(yǎng)殖時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。使用了微生物菌劑組(組2、組3和組4)的生長速度和成活率均明顯高于對照組(組1)(P<0.050)，其中體重增長率比對照組(組1)分別提升了106.3%、131.2%和175.0%，成活率比對照組(組1)分別提升了40.9%、43.4%和43.8%。上述結(jié)果表明，噴灑在飼料上的微生物菌劑對對蝦有明顯的促生長作用，而且能明顯地提升其存活率。

表1 試驗(yàn)33 d后各組的體長、體重、增重率和成活率Tab.1 The body length, weight, weight gain rate and survival rate of each group after 33 d incubation

注：表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.050)

Note:There was significant difference in shoulder mark of the same column of data in the table (P<0.050)

2.2 微生物菌劑對飼養(yǎng)池底泥中弧菌數(shù)量的影響

在對蝦的培育過程中，弧菌(Vibriospp.)對其危害較大[13-15]。當(dāng)環(huán)境條件惡化，對蝦抵抗力降低時(shí)，弧菌就會(huì)乘虛而入，引起對蝦的病變，使其生長緩慢乃至死亡。從圖1可以看出，對照組(組1)的弧菌個(gè)數(shù)是使用了微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)中的弧菌個(gè)數(shù)的14倍。在養(yǎng)殖前期(2018年5月23日)，四個(gè)組飼養(yǎng)池中，1 g池底干泥中弧菌的數(shù)量無顯著差異(P>0.050)。在養(yǎng)殖初期(前10 d)，對照組(組1)的弧菌數(shù)呈上升趨勢，而使用了微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)弧菌個(gè)數(shù)則緩慢減少(P=0.000)。以上結(jié)果表明，使用微生物菌劑能有效改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，抑制有害菌體的生長。

圖1 試驗(yàn)期間各組飼養(yǎng)池中1 g池底干泥中弧菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamics of Vibrios during the 33 d incubation

2.3 微生物菌劑對養(yǎng)殖水體中pH和DO含量的影響

水中的酸堿度可直接影響對蝦的新陳代謝，在對蝦的生長過程中起著至關(guān)重要的作用。將各數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析，不同時(shí)間的pH值具有顯著差異性(P<0.050)。如圖2a所示，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增長，使用了微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)的pH值逐漸降低，組4最低值達(dá)到7.01，對照組下降曲線則較為平緩。組1與組4在第0天時(shí)數(shù)據(jù)不具有顯著差異性(P>0.050)，第10天以后出現(xiàn)顯著差異(P<0.050)，這說明含2.0%的微生物菌劑的飼料可降低pH值。以上結(jié)果表明，使用微生物菌劑有助于控制養(yǎng)殖水池的pH值，以達(dá)到養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量的要求。

養(yǎng)殖水體中的溶解氧是對蝦養(yǎng)殖過程中影響生長的重要因素，充足的溶解氧有助于對蝦生長。在四次采樣數(shù)據(jù)中，不同時(shí)間的溶解氧具有顯著差異(F=191.959,P=0.000)。從圖2b可以看出，4個(gè)組的溶氧量在33 d時(shí)間內(nèi)呈下降趨勢，使用了微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)水中DO含量比對照組(組1)高，養(yǎng)殖期間(2018年5月23日至2018年6月24日)DO含量波動(dòng)范圍在5.46～6.67 mg/L之間，對照組(組1)養(yǎng)殖水池中DO含量波動(dòng)范圍在4.39～6.45 mg/L之間。從各時(shí)間點(diǎn)看，除了第0天4個(gè)組的數(shù)據(jù)和第10天組3、組4的數(shù)據(jù)不具有顯著差異外(P>0.050)，其他時(shí)間點(diǎn)均以對照組的DO含量最低(P<0.050)。上述結(jié)果表明，使用微生物菌劑，能增加水體的DO，保證了對蝦的正常生長。

圖2 試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中pH和DO含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics of pH and DO content in aquaculture water during the 33 d incubation(a)試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中pH含量的動(dòng)態(tài)變化;(b)試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中DO含量的動(dòng)態(tài)變化(a)Dynamics of pH content in aquaculture water during the 33 d incubation;(b)Dynamics of DO content in aquaculture water during the 33 d incubation

2.4 微生物菌劑對養(yǎng)殖水體中氮素形態(tài)的影響

氨氮(NH4-N)是養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，濃度過高會(huì)制約對蝦的養(yǎng)殖和造成水體富營養(yǎng)化等環(huán)境污染[16]。如圖3a所示：在養(yǎng)殖初期(前10 d)，4個(gè)養(yǎng)殖水池的NH4-N質(zhì)量濃度都呈上升趨勢，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，使用微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)中的NH4-N質(zhì)量濃度逐漸減少，而對照組(組1)的NH4-N質(zhì)量濃度繼續(xù)呈現(xiàn)上升趨勢(F=250.633，P=0.000)；在養(yǎng)殖前期(2018年5月23日)，4個(gè)養(yǎng)殖水池的NH4-N質(zhì)量濃度無顯著差異(P>0.050)，其他時(shí)間點(diǎn)均以對照組的NH4-N質(zhì)量濃度最高(P<0.050)；到養(yǎng)殖后期，使用微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)中的NH4-N質(zhì)量濃度均低于0.070 mg/L，而對照組(組1)的NH4-N質(zhì)量濃度已達(dá)0.162 mg/L。

圖3 試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中NH4-N、NO2-N和NO3-N的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamics of NH4-N, NO2-N and NO3-N in aquaculture water during the 33 d incubation(a)試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中NH4-N的動(dòng)態(tài)變化;(b)試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中NO2-N的動(dòng)態(tài)變化;(c)試驗(yàn)期間各組養(yǎng)殖水體中NO3-N的動(dòng)態(tài)變化(a)Dynamics of NH4-N in aquaculture water during the 33 d incubation;(b)Dynamics of NO2-N in aquaculture water during the 33 d incubation;(c)Dynamics of NO3-N in aquaculture water during the 33 d incubation

海水中亞硝酸氮(NO2-N)作為硝態(tài)氮(NO3-N)和銨態(tài)氮(NH4-N)還原與氧化過程的中間產(chǎn)物[17]，含量相對較低且不穩(wěn)定，但在蝦塘養(yǎng)殖水環(huán)境中含量相對較高，經(jīng)常被作為水質(zhì)的一個(gè)考核指標(biāo)。亞硝酸氮(NO2-N)也是養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，濃度過高同樣會(huì)制約對蝦的養(yǎng)殖。如圖3b所示：在養(yǎng)殖前期(2018年5月23日)，4個(gè)養(yǎng)殖水池的NO2-N質(zhì)量濃度均為0 mg/L，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的變化，4個(gè)養(yǎng)殖水池的NO2-N質(zhì)量濃度逐漸上升(F=659.806，P=0.000)；到了養(yǎng)殖后期，對照組(組1)水中的亞硝酸氮質(zhì)量濃度均高于試驗(yàn)組(P<0.050)，達(dá)到了0.062 mg/L，而使用了微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)水體中的亞硝酸氮質(zhì)量濃度維持了較低的水平(P<0.050)。

海水中硝酸氮(NO3-N)是含氮有機(jī)物氧化分解的最終產(chǎn)物。水中的氮以硝酸鹽形態(tài)存在，屬低毒性或無毒性。其含量變化主要受海洋生物活動(dòng)和有機(jī)質(zhì)氧化分解的影響。如圖3c所示，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的變化，4個(gè)組中的NO3-N質(zhì)量濃均有增加(F=1 937.649,P=0.000)，但使用微生物菌劑的試驗(yàn)組(組2、組3和組4)中的NO3-N質(zhì)量濃度始終低于對照組(組1)(P<0.050)。

以上結(jié)果表明，微生物菌劑中的有益微生物能利用水體中的無機(jī)氮，使得養(yǎng)殖水體中的NH4-N、NO2-N和NO3-N維持在一個(gè)較低的水平，保證了對蝦生存環(huán)境的健康。

3 討論

在本研究中，復(fù)合微生物菌劑作為飼料添加劑對對蝦有很明顯的促生長作用，在第33天，對照組與各試驗(yàn)組的體重具有顯著差異性(P<0.050)，同時(shí)復(fù)合微生物菌劑還能顯著地提升對蝦的存活率。之前有報(bào)道指出，微生物菌劑中含有許多可提高動(dòng)物免疫能力的生理活性物質(zhì)[18]，復(fù)合微生物菌劑中的益生菌定植在對蝦腸道中可增強(qiáng)對蝦的抗病力，提高其成活率[19-21]。Dicks等[22-24]的研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母菌、乳酸菌、放線菌、芽孢桿菌和光合細(xì)菌等有益菌的復(fù)合微生物菌劑不僅可以抑制對蝦體內(nèi)病原菌生長，還能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，如維生素、類胡蘿卜素和促生長因子等。本文中所用微生物菌劑中的益生菌也具有類似的效果，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可促進(jìn)宿主消化吸收[25]，因此能夠有效地促進(jìn)對蝦生長并能凈化水質(zhì)。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水體DO值和pH值是養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，DO值在試驗(yàn)開始時(shí)各組數(shù)據(jù)中不具有顯著差異，而在養(yǎng)殖10 d后，對照組與各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)出現(xiàn)顯著差異(P<0.050)，且溶氧量低于試驗(yàn)組，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長，水體溶氧量會(huì)逐漸降低，但是添加微生物菌劑的試驗(yàn)組水體溶氧量在養(yǎng)殖期間始終高于對照組。養(yǎng)殖環(huán)境的酸堿度也能影響對蝦的生長代謝，在養(yǎng)殖期間，各組pH值呈下降趨勢(F=191.959,P=0.000)，且試驗(yàn)組為7.0左右，而對照組呈弱堿性環(huán)境。有研究報(bào)道，乳酸菌和光合細(xì)菌都能增加水體溶氧量，調(diào)控水體酸堿度[26]，這說明微生物菌劑中的乳酸菌可能在調(diào)節(jié)水質(zhì)方面發(fā)揮著重要的作用。

水質(zhì)的好壞是養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，微生物菌劑中的有益微生物能吸收和利用養(yǎng)殖水體中的無機(jī)氮，氨化功能細(xì)菌和硝化功能細(xì)菌在生物脫氨的各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮協(xié)同作用，把有害的亞硝酸氮轉(zhuǎn)化為無害的硝酸鹽和菌體蛋白，從而使養(yǎng)殖水體的水質(zhì)維持在對蝦健康生長的標(biāo)準(zhǔn)，在維持養(yǎng)殖環(huán)境的生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[16,17]。隨著對蝦的生長，各類有毒氮素含量會(huì)逐漸增加，在監(jiān)測NH4-N、NO2-N和NO3-N動(dòng)態(tài)變化的試驗(yàn)中，除了第0天各組數(shù)據(jù)無顯著差異外(P>0.050)，各試驗(yàn)組的氮素含量均低于對照組，F(xiàn)值分別為250.633、659.806和1 937.649，P值均為0.000。表明復(fù)合微生物菌劑可促進(jìn)有害氮素轉(zhuǎn)化為無害的硝酸鹽，維持較好的水質(zhì)環(huán)境。

總之，復(fù)合微生物菌劑作為飼料添加劑，可增強(qiáng)對蝦的抗病力，促進(jìn)對蝦的消化吸收生長，在提高幼蝦成活及成蝦產(chǎn)量等問題上有較高的使用價(jià)值，且具有捕撈后無獸藥、激素等殘留的優(yōu)點(diǎn)，可有效替代抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。作為凈水劑，在消除有機(jī)物污染、凈化水質(zhì)的同時(shí)，還能有效抑制水體中有害微生物的生長繁殖，顯示出良好的應(yīng)用效果。