劉 樂(lè)，廖旻晶，徐 葉，劉如石，鐘志宏*，王慶林*

(1.湖南省免疫診斷試劑工程研究中心， 長(zhǎng)沙410006； 2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 長(zhǎng)沙410006)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是人群中普遍存在的皰疹病毒家族5型的成員，屬于β皰疹病毒亞科。HCMV成熟病毒顆粒的大小為150～200 nm，核心為雙鏈線形DNA，外包呈二十面體對(duì)稱的衣殼，核衣殼外有一層被膜，病毒的最外層是含有病毒編碼的多種糖蛋白的脂質(zhì)包膜。HCMV具有種屬特異性，主要在人與人之間傳播，可通過(guò)唾液、尿液、母乳喂養(yǎng)、胎盤、性交、血液和器官移植等多種方式進(jìn)行傳播。臨床上，免疫系統(tǒng)功能正常的人群感染HCMV后通常是無(wú)癥狀的，然而在免疫缺陷個(gè)體中則表現(xiàn)為嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病[1]。此外，HCMV是引起胎兒先天性畸形最常見(jiàn)的感染原因[2,3]，也是造血干細(xì)胞和實(shí)體器官移植受者感染和死亡的主要原因[4]。

目前沒(méi)有較好的治療HCMV感染的方法，其主要治療藥物為更昔洛韋和纈更昔洛韋，但這些藥物有嚴(yán)重的副作用?；谏鐣?huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及缺乏有效治療方案，HCMV已被指定為最優(yōu)先的疫苗目標(biāo)之一[5]。早期開(kāi)發(fā)的減毒活疫苗如AD169和Towne，雖然可以誘導(dǎo)短暫的中和抗體應(yīng)答，但不能徹底清除體內(nèi)病毒，阻斷病毒對(duì)上皮細(xì)胞的感染。近幾十年來(lái)，HCMV亞單位疫苗研究主要集中在刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體(neutralizing antibody，NAb)所必需的包膜糖蛋白gB(glycoprotein B)上。與佐劑MF59混合的重組gB疫苗預(yù)防育齡婦女HCMV原發(fā)感染的有效率為38%～50%，但無(wú)法預(yù)防青少年的HCMV原發(fā)性感染[6,7]。HCMV gH(glycoprotein H)也是HCMV必需的包膜糖蛋白[8]，并能誘導(dǎo)針對(duì)病毒的中和抗體，是HCMV亞單位疫苗的候選抗原[9]，但目前針對(duì)gH中和抗體的研究甚少。

gH由HCMVUL75基因編碼，基因全長(zhǎng)為2 232 bp，編碼742個(gè)氨基酸。gH與gB、gL(glycoprotein L)構(gòu)成了HCMV的核心融合機(jī)制，在HCMV融合、進(jìn)入和感染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10,11]，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶點(diǎn)[12]。有研究表明，gH是人巨細(xì)胞病毒主要的中和抗原[13,14]，機(jī)體產(chǎn)生的抗gH抗體可中和進(jìn)入上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特異性毒株[15]，有效干擾HCMV對(duì)上述細(xì)胞的感染[8,16,17]。因此，本研究擬通過(guò)重組表達(dá)及雜交瘤技術(shù)，獲得重組gH蛋白及抗gH蛋白的單克隆抗體，以期為HCMV疫苗開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株、試驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

本試驗(yàn)所用原核表達(dá)質(zhì)粒為pET32a′，經(jīng)pET32a改造而來(lái)，即去除后者Trx標(biāo)簽及部分酶切位點(diǎn)，具體去除部位為堿基的203～689位；原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a、TransB菌株、TOP10F′菌株及HCMV Toledo由本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c雄鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；GAM-IgG-HRP由廈門大學(xué)夏寧邵教授惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI以及DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRat公司；抗6×His-tag單克隆抗體、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生工公司；HCMV陽(yáng)性血清由湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)；HT、HAT以及弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；1640培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自上海依科賽生物科技有限公司；ECL(eletrochemiluminescence)顯色液購(gòu)自莫納生物科技有限公司。

1.2 HCMV gH基因擴(kuò)增

以含HCMV Toledo全基因組的BAC(bacterial artificial chromosome)為模板，擴(kuò)增去除信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列的gH基因片段，設(shè)計(jì)的上游引物: 5′-CCGGAATTCTCCGAAGCGCTGGACCCTC-3′；下游引物：5′-GGGCTCGAGACGACTGTCGGTGGCGTCC-3′(波浪線標(biāo)注的分別為EcoR I和XhoI的酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)注的分別為酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基)。引物由長(zhǎng)沙擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共28個(gè)循環(huán)。目的片段經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析并回收。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.4 HCMV gH蛋白的表達(dá)與純化

將鑒定后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TransB表達(dá)菌株，挑單菌落于3 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液OD600 nm值至0.6～0.8時(shí)，加入質(zhì)量濃度為200 mg/L的異丙基-β-D-硫代半苷 (isopropyl-β-D-thiogalactopryanoside，IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，離心收集誘導(dǎo)前后的菌體并用超聲波破碎，制備誘導(dǎo)前后菌株的蛋白樣進(jìn)行10%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfonate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和免疫印跡(western blot,WB)鑒定。用同種方法大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，離心收菌并用超聲波破碎，將誘導(dǎo)后的菌液、超聲后懸液以及懸液離心后上清、沉淀分別制樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE及WB鑒定重組蛋白的表達(dá)方式，WB所用一抗為抗6×His-tag單抗。

用含2%TritonX-100的Buffer I溶液和Buffer I溶液分別洗滌沉淀，然后用4 mol/L尿素溶液變性蛋白，12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸、制樣。蛋白樣經(jīng)10%SDS-PAGE后，切取gH蛋白對(duì)應(yīng)的目的條帶于透析袋內(nèi)，并在加有Tris-甘氨酸緩沖液的水平電泳槽進(jìn)行電泳，條件為電壓100 V、2 h。電洗脫后，去掉透析袋中的凝膠，并加入二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)至終濃度50.00 mmol/L，將透析袋放在含DTT的PBS中，透析液中DDT濃度依次為50.00、25.00、12.50和6.25 mmol/L，最后將透析液全部換成PBS，4 ℃各攪拌透析2 h。透析結(jié)束后，回收透析袋中蛋白溶液并制樣，經(jīng)SDS-PAGE和WB鑒定重組蛋白。WB所用一抗分別為抗6×His-tag單抗、HCMV陽(yáng)性血清。

1.5 小鼠免疫

將純化后的蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化后，皮下多點(diǎn)免疫8周齡的BALB/c雄鼠，劑量為150 μg/只。2周后，純化蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化，然后以同樣的劑量和方法對(duì)小鼠進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫，每次間隔2周。在細(xì)胞融合前3 d，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫，劑量為150 μg/只。每次免疫前1 d對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢取血，通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清效價(jià)。

1.6 細(xì)胞融合

終免3 d后取免疫小鼠的脾臟,收集脾細(xì)胞，按1∶10的比例與生長(zhǎng)狀態(tài)良好的骨髓瘤細(xì)胞sp2/0進(jìn)行混合，在37 ℃預(yù)熱的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)1500作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，并用無(wú)血清1640培養(yǎng)基終止融合。用含HAT的20%FBS-1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，然后均勻鋪于96孔板中，放于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 雜交瘤細(xì)胞的篩選

融合后的細(xì)胞在培養(yǎng)第7天用含10%FBS的HT-1640培養(yǎng)基換液，待細(xì)胞集落長(zhǎng)至孔底面積的1/3～1/2時(shí)，取培養(yǎng)液上清作為一抗，用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。選取OD450 nm值較高且細(xì)胞集落數(shù)目少的孔，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行克隆化。通過(guò)4次亞克隆，以保證重篩選的細(xì)胞為可穩(wěn)定分泌gH抗體的雜交瘤細(xì)胞。

1.8 單克隆抗體的制備、純化和鑒定

取9周齡的雄性BALB/c小鼠，按每只500 μL的劑量腹腔注射石蠟油。9 d后用PBS將雜交瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×106個(gè)/mL，按每只500 μL的劑量腹腔注射小鼠。10 d后，收集腹水，通過(guò)辛酸-飽和硫酸銨沉淀和Protein A柱對(duì)腹水進(jìn)行純化，將純化前后的腹水進(jìn)行12%SDS-PAGE鑒定。

1.9 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定

1.9.1 亞型檢測(cè)

使用間接ELISA法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。取篩選的每株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液作為一抗，分別以抗 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgGAM的抗體作為二抗，其中IgGAM作為陽(yáng)性對(duì)照。另設(shè)陰性對(duì)照，以配制的細(xì)胞培養(yǎng)基作為一抗，IgGAM作為二抗。

1.9.2 抗體效價(jià)

將純化的單克隆抗體作為一抗，使用間接ELISA法測(cè)定。檢測(cè)效價(jià)時(shí)，將5種抗體的質(zhì)量濃度均稀釋為0.59 g/L，然后從1∶800進(jìn)行2倍比稀釋，直至最終稀釋比為 1∶204 800。

1.9.3 反應(yīng)性檢測(cè)

將純化后的重組gH蛋白作為抗原，分別以篩選并純化后的單克隆抗體作為一抗，同時(shí)以抗6×His-tag單抗作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)WB檢測(cè)5種單抗對(duì)重組gH蛋白的反應(yīng)性。

1.9.4 人巨細(xì)胞病毒的培養(yǎng)及單克隆抗體的免疫捕獲PCR

用含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng) ARPE-19(adult retinal pigment epithelial cell line-19)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，向培養(yǎng)液中加入HCMV Toledo病毒液，感染量為1 000 PFU/皿，置于5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，期間每隔15 min輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿。2 h后，將培養(yǎng)液換為含2%FBS的 DMEM/F-12 培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。待細(xì)胞大部分發(fā)生病變后，用2 mL左右上清液將ARPE-19細(xì)胞充分懸浮，并收集于凍存管中。將凍存管反復(fù)凍融3次后，在4 ℃環(huán)境中10 416 r/min離心30 min，上清即為具有感染性的病毒液，留取上清備用。

單克隆抗體的免疫捕獲試驗(yàn)分為抗體捕獲病毒陰性對(duì)照(不包被抗體僅加病毒液),抗體試驗(yàn)組(包被抗體加病毒液)和抗體陰性對(duì)照(僅包被抗體不加病毒液)。具體操作如下：純化單克隆抗體用PBS(pH 7.4)稀釋至8 μg/mL，包被到0.5 mL離心管中，每個(gè)抗體包被兩管，每管100 μL。同時(shí)以僅包被等量包被液的離心管作為抗體捕獲病毒陰性對(duì)照，4 ℃過(guò)夜。1×PBS洗滌3次后，用200 μL ED封閉液于37 ℃封閉2 h，1×PBS 洗滌3次；每個(gè)抗體包被管中分別加入100 μL病毒液與正常細(xì)胞裂解液，作為抗體實(shí)驗(yàn)組與抗體陰性對(duì)照，僅包被包被液的離心管中加入等量病毒液，37 ℃ 孵育2 h；1×PBS洗滌6次。加入30 μL ddH2O，于PCR儀器上95 ℃熱處理 15 min。之后，以水溶液為模板進(jìn)行g(shù)H基因片段的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，并用瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。其中模板陰、陽(yáng)性對(duì)照分別以ddH2O、重組質(zhì)粒pET32a′-gH為模板，其余操作一樣。PCR反應(yīng)程序同步驟1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET32a′-gH的構(gòu)建

以含HCMV Toledo毒株全基因組的BAC為模板，PCR擴(kuò)增不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列的gH基因，理論上PCR產(chǎn)物為2 064 bp。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照無(wú)條帶，陽(yáng)性樣品在2 000 bp附近有一條較亮的條帶，初步確定為gH基因片段(圖1a)。純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，與pET32a′構(gòu)建重組表達(dá)載體。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切后，理論上會(huì)有2條片段，分別為2 064 bp的gH基因和5 414 bp的線性質(zhì)粒pET32a′。將酶切前后的樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙酶切后有2條條帶，分別位于5 000 bp和2 000 bp左右，與理論相符(圖1b)。同時(shí),提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，插入片段的核苷酸序列與預(yù)期相符，提示該重組質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)的蛋白表達(dá)。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a′-gH的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pET32a′- gH(a)gH基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。Lane M：DNA的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1、2：gH基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；Lane 3：以ddH2O為模板的陰性對(duì)照；(b)重組質(zhì)粒pET32a′-gH的雙酶切鑒定結(jié)果。Lane M：DNA的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1：構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒；Lane 2：重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I/Xho I雙酶切后產(chǎn)物(a)The results of agarose gel electrophoresis of amplified products of gH gene.Lane M:Relative molecular mass standard of DNA;Lane 1 and Lane 2:Specific amplification products of gH gene;Lane 3:Negative control with ddH2O as template;(b)Results of double enzyme digestion of recombinant plasmid pET32a′-gH. Lane M:The relative molecular mass standard of DNA;Lane 1:The successful construction of a recombinant plasmid;Lane 2:The pro-duct of the recombinant plasmid after digestion by EcoR I/Xho I

2.2 重組gH蛋白的表達(dá)及純化

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TransB菌株，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。分別留取IPTG誘導(dǎo)前后的蛋白樣，并通過(guò)SDS-PAGE、WB鑒定蛋白表達(dá)情況。SDS-PAGE結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的重組菌株表達(dá)了一個(gè)約70 kD的蛋白(圖2a)。為驗(yàn)證誘導(dǎo)表達(dá)蛋白是否為gH蛋白，我們以抗6×His-tag抗體作為一抗，使用WB對(duì)重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)菌株在70 kD處出現(xiàn)了特異性條帶，而對(duì)照菌株中沒(méi)有出現(xiàn)(圖2b)，提示菌株所表達(dá)的70 kD蛋白處為含有6×His-tag的重組蛋白。超聲波破碎后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌株，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白主要存在于沉淀中，說(shuō)明該蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)(圖2a)。使用WB對(duì)重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，與SDS-PAGE結(jié)果一致(圖2b)。大量表達(dá)gH，收集沉淀，后者經(jīng)洗滌、尿素變性后，用電洗脫方法進(jìn)行純化，收集純化前后的蛋白樣，并通過(guò)SDS-PAGE和WB鑒定gH純化情況(圖3)。結(jié)果顯示：與純化前相比，純化后gH僅有1條較亮的條帶，gH重組蛋白純化率達(dá)90%以上，達(dá)到免疫小鼠制備單克隆抗體的要求。

圖2 重組gH蛋白的原核表達(dá)Fig.2 Eukaryotic expression of recombinant gH protein 通過(guò)SDS-PAGE(a)及WB(b)鑒定重組gH蛋白的表達(dá)情況。Lane M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌株；Lane 2：IPTG誘導(dǎo)后菌株；Lane 3：超聲懸液；Lane 4：超聲懸液離心后上清；Lane 5：超聲懸液離心后沉淀Identification of the expression of recombinant gH protein by SDS-PAGE (a) and WB (b).Lane M:Relative molecular mass standard of predyed protein;Lane 1:Strains not induced by IPTG;Lane 2:Strains induced by IPTG;Lane 3:Ultrasonic suspension;Lane 4:Ultrasonic suspension supernatant after centrifugation;Lane 5:Ultrasonic suspension precipitation after centrifugation

圖3 重組gH蛋白的純化鑒定Fig.3 Identification of purified recombinant gH (a)SDS-PAGE 鑒定純化后重組gH蛋白；(b)WB 鑒定純化后重組gH蛋白(所用一抗為抗6×His-tag)；(c)WB 鑒定重組gH蛋白表達(dá)方式 (所用一抗為HCMV陽(yáng)性血清)；Lane M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1：未經(jīng)純化的蛋白；Lane 2：經(jīng)電洗脫純化后的蛋白(a)The purified recombinant gH were identified by SDA-PAGE;(b)The purified recombinant gH were identified by WB，and the first antibody used was anti 6×His-tag;(c)The purified recombinant gH were identified by WB,and the first antibody used was HCMV positive serum.Lane M:Relative molecular mass standard of predyed protein;Lane 1:The unpurified protein;Lane 2:The protein purified by electroelution

2.3 抗gH單克隆抗體的制備及純化

用純化后的gH蛋白免疫小鼠，將小鼠免疫前的血清1∶4 000稀釋后作為陰性對(duì)照，以大于2.1倍陰性值作為陽(yáng)性。結(jié)果顯示，經(jīng)5次免疫后，小鼠血清抗體含量明顯升高，效價(jià)可達(dá)1∶100 000(圖4)，達(dá)到制備單克隆抗體的要求。免疫后取小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞融合、亞克隆化培養(yǎng)，篩選出5株能穩(wěn)定分泌抗HCMV gH 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。

圖4 免疫小鼠的血清效價(jià)檢測(cè)Fig.4 The examination of serum titer in mice after immunization

將適量雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠腹腔，7～15 d后收集小鼠腹水。使用辛酸-飽和硫酸銨沉淀和Protein A柱進(jìn)行純化，將純化前后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示,純化后的抗體樣品未經(jīng)煮沸時(shí)出現(xiàn)3條帶，分別為50 kD的重鏈、25 kD的輕鏈和大小約100 kD的條帶。100 kD的條帶為重鏈與重鏈的聚合體，由于兩條重鏈間的二硫鍵沒(méi)有完全破壞所形成(圖5)。煮沸后的抗體樣品主要有2條帶，分別為50 kD的重鏈和25 kD的輕鏈，且與煮沸前相比，50 kD處條帶變粗。凝膠電泳結(jié)果顯示，樣品中雜帶很少，提示單克隆抗體達(dá)到很高純度，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 純化單克隆抗體的SDS-PAGE鑒定Fig.5 Identification of purified monoclonal antibodies by SDS-PAGELane M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1：經(jīng)10倍稀釋處理的未煮沸腹水樣品；Lane2：經(jīng)10倍稀釋處理的煮沸腹水樣品；Lane 3：未煮沸的辛酸硫酸銨沉淀處理后的腹水樣品；Lane 4：煮沸的辛酸硫酸銨沉淀處理后的腹水樣品；Lane 5：未煮沸的經(jīng)protein A柱純化處理的腹水樣品；Lane 6：煮沸的經(jīng)protein A柱純化處理的腹水樣品Lane M:Relative molecular mass standard of predyed protein;Lane 1:Unboiled ascites treated by 10 times dilution;Lane 2:Boiled ascites treated by 10 times dilution;Lane 3:Unboiled ascites treated by purification after precipitation of ammonium caproate sulfate;Lane 4:Boiled ascites treated by purification after precipitation of ammonium caproate sulfate;Lane 5:Unboiled ascites treated by purification after proteinA-column;Lane 6:Boiled ascites treated by purifi-cation after proteinA-column

2.4 單克隆抗體性質(zhì)鑒定

2.4.1 亞型鑒定

將OD450 nm>1.0作為陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)果顯示，除IgGAM外，5株抗體僅與IgG2a呈陽(yáng)性反應(yīng)，故8A9、8B4、8C4、8D9、8D12亞型均為IgG2a型(圖6)。

圖6 五株單克隆抗體的亞型檢測(cè)Fig.6 Examination of the subtype of 5 monoclonal antibodies

2.4.2 單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

以PBS作為陰性對(duì)照，以大于2.1倍陰性值作為陽(yáng)性，結(jié)果顯示，8A9的效價(jià)達(dá)1∶51 200，8B4的效價(jià)達(dá)1∶6 400，8C4的效價(jià)達(dá)1∶102 400，8D9的效價(jià)達(dá)1∶102 400，8D12的效價(jià)達(dá)1∶6 400。試驗(yàn)結(jié)果提示，這5株單克隆抗體的活性為8C4=8D9>8A9>8B4=8D12(圖7)。

圖7 五株單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)Fig.7 Titer test of 5 monoclonal antibodies

2.4.3 單克隆抗體的免疫反應(yīng)性檢測(cè)

分別以單抗8A9、8B4、8C4、8D9、8D12和抗6×His-tag為一抗，利用WB鑒定單克隆抗體對(duì)重組gH蛋白的免疫反應(yīng)性(圖8)，結(jié)果顯示，5種單克隆抗體與純化的重組gH蛋白反應(yīng)后均在目標(biāo)位置出現(xiàn)一條明顯的條帶，提示這5種單克隆抗體能特異性識(shí)別重組gH蛋白。

圖8 五株單克隆抗體對(duì)gH蛋白的免疫反應(yīng)性檢測(cè)Fig.8 The immunoreactivity of monoclonal antibodies with gH protein(a)重組gH蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；(b)單克隆抗體對(duì)重組gH蛋白的WB結(jié)果；Lane M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1：純化的gH蛋白；(1)～(6)對(duì)應(yīng)一抗分別為8A9、8B4、8C4、8D9、8D12和抗6×His-tag(a)Result of recombinant gH protein by SDA-PAGE;(b) Immunoreactivity of monoclonal antibodies with gH protein by WB detection;Lane M:Relative molecular mass standard of predyed protein;Lane 1:Purified gH protein;(1)～(6) Corresponding antibodies are 8A9,8B4,8C4,8D9,8D12,and 6×His-tag,respectively

2.4.4 單克隆抗體的免疫捕獲PCR

用免疫捕獲PCR 檢測(cè)抗gH單克隆抗體捕獲HCMV的能力。當(dāng)抗體可以捕獲病毒時(shí)，二者可特異性結(jié)合，不能結(jié)合的病毒則被PBS洗掉?？贵w-病毒結(jié)合物在95 ℃可釋放病毒于水溶液中，以水溶液作為模板，利用gH特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中模板陰性對(duì)照、抗體捕獲病毒試驗(yàn)陰性對(duì)照與8C4試驗(yàn)組、陰性對(duì)照均無(wú)條帶；模板陽(yáng)性對(duì)照，8A9、8B4、8D9、8D12抗體試驗(yàn)組在2 000 bp附近有一條特異的條帶，條帶大小與理論一致。說(shuō)明抗體8A9、8B4、8D9、8D12均可以捕獲HCMV，且8D9和8D12的捕獲能力較強(qiáng),8C4不可以捕獲病毒(圖9)。

圖9 五株單克隆抗體的病毒捕獲能力檢測(cè)Fig.9 Detection of virus capture ability of monoclonal antibodiesLane M：DNA的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1：模板陰性對(duì)照；lane 2：抗體捕獲病毒試驗(yàn)陰性對(duì)照；Lane 3：模板陽(yáng)性對(duì)照；Lane 4：8A9試驗(yàn)組；Lane 5：8A9陰性對(duì)照；Lane 6：8B4試驗(yàn)組；Lane 7：8B4陰性對(duì)照；Lane 8：8C4試驗(yàn)組；Lane 9：8C4陰性對(duì)照；Lane 10：8D9試驗(yàn)組；Lane 11：8D9陰性對(duì)照；Lane 12：8D12試驗(yàn)組；Lane 13：8D12陰性對(duì)照Lane M:Relative molecular mass standard of DNA;Lane 1:Template negative control;Lane 2:Negative control of antibody capture virus test;Lane 3:Template positive control;Lane 4:Test group sample of 8A9;Lane 5:Negative control of 8A9;Lane 6:Test group sample of 8B4;Lane 7:Negative control of 8B4;Lane 8:Test group sample of 8C4;Lane 9:Negative control of 8C4;Lane 10:Test group sample of 8D9;Lane 11:Negative control of 8D9 ;Lane 12:Test group sample of 8D12;Lane 13:Negative control of 8D12

3 討論

本試驗(yàn)利用HCMV臨床株Toledo作為gH基因擴(kuò)增模板及后續(xù)的免疫捕獲試驗(yàn)。Toledo是從一名先天性感染HCMV的兒童中分離出來(lái)的低傳代毒株，用于人類巨細(xì)胞病毒感染研究[18]。與HCMV實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)病毒株AD169相比，Toledo毒株基因組DNA具有一段長(zhǎng)達(dá)15 kb左右的基因區(qū)域(UL133-UL151)，可能與HCMV介導(dǎo)的免疫致病機(jī)制有關(guān)[19]。有研究表明，試驗(yàn)株如AD169、Towne在試驗(yàn)過(guò)程中已經(jīng)失去了感染上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力[20]，而臨床株可以彌補(bǔ)這個(gè)缺陷[21]。故Toledo在HCMV培養(yǎng)及與抗體研究方面具有一定的優(yōu)越性。

本研究中g(shù)H全基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中無(wú)法表達(dá)，而去除了信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列的gH基因片段可成功表達(dá)。說(shuō)明信號(hào)肽和跨膜區(qū)基因序列對(duì)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)有一定的影響，這與金映紅等研究者的觀點(diǎn)一致[22-25]。此外，誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間可影響蛋白的表達(dá)量及表達(dá)方式[26]。本試驗(yàn)在16、25、30、37 ℃分別誘導(dǎo)表達(dá)15、9、10、4 h，發(fā)現(xiàn)該gH蛋白在25 ℃、誘導(dǎo)表達(dá)9 h后，蛋白的表達(dá)量最高，故在該條件下進(jìn)行g(shù)H蛋白的表達(dá)。表達(dá)的gH蛋白均以包涵體的形式存在，且不溶于尿素，故本試驗(yàn)利用電洗脫方式進(jìn)行純化[27]。電洗脫純化蛋白方法簡(jiǎn)單、純化效率高，蛋白純度可達(dá)90%以上，可用于BALB/c小鼠免疫。本試驗(yàn)每次免疫小鼠的蛋白量為150 μg/只，該免疫量可刺激BALB/c小鼠持續(xù)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，且不會(huì)產(chǎn)生免疫耐受。在進(jìn)行5次免疫后，小鼠血清效價(jià)達(dá)1∶100 000以上，說(shuō)明gH蛋白具有較好的免疫原性。免疫后的小鼠可用于后期的細(xì)胞融合。細(xì)胞融合后，為篩選得到可穩(wěn)定分泌的、專一的抗gH抗體的雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)行了4次亞克隆試驗(yàn)，最終篩選出5株雜交瘤細(xì)胞，將其分別命名為8A9、8B4、8C4、8D9和8D12。

利用WB及間接ELISA等試驗(yàn)鑒定發(fā)現(xiàn)，5株抗體均具有良好的免疫反應(yīng)性，其中8A9、8C4和8D9具有較高的效價(jià)和親和力。通過(guò)捕獲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8A9、8B4、8D9、8D12可捕獲HCMV Toledo，說(shuō)明這4種抗體與HCMV Toledo有較好的親和力，為后續(xù)檢測(cè)抗體的中和能力奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也說(shuō)明這4種抗體具有應(yīng)用于HCMV診斷的潛力。鑒于8D9、8D12捕獲能力較強(qiáng)，后續(xù)將利用病毒中和試驗(yàn)和阻斷試驗(yàn)，檢測(cè)這2種抗體能否中和病毒、阻斷HCMV在細(xì)胞間傳播，從而進(jìn)一步完善抗體的性質(zhì)，以便為中和抗體的篩選提供原材料。