文海若 顏玉靜 宋捷 鄂蕊 馬雙成 汪祺
摘 要 目的:評價大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(EG)的體內(nèi)外遺傳毒性,并比較體外細(xì)胞試驗(yàn)及大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價結(jié)果的差異。方法:采用體外二維(2D)、三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)法分別構(gòu)建2D、3D HepaRG細(xì)胞模型,造模成功后,分別將2D、3D HepaRG細(xì)胞分為空白對照組[0.5%二甲基亞砜(DMSO)]、絲裂霉素C組(陽性對照,0.1 ?g/mL)和EG低、中、高劑量組(10、50、200 ?g/mL),然后檢測各組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量。將SD大鼠分為空白對照組(0.5%羧甲基纖維素鈉)、甲磺酸乙酯組(陽性對照,200 mg/kg)和EG低、中、高劑量組(100、300、1 000 mg/kg),每組6只,連續(xù)灌胃給藥15 d,每天1次;15 d后檢測各組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率及外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞的尾DNA百分含量、尾距。結(jié)果:在體外2D HepaRG細(xì)胞模型中,與空白對照組比較,絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高(P<0.01),EG各劑量組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在3D HepaRG細(xì)胞模型中,與空白對照組比較,絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高(P<0.01或P<0.001),EG高劑量組HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量顯著升高(P<0.01)。在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,與空白對照組比較,甲磺酸乙酯組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率和外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞的尾DNA百分含量、尾距均顯著升高(P<0.01),EG高劑量組大鼠外周血淋巴細(xì)胞尾DNA百分含量顯著升高(P<0.01),EG各劑量組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率和肝細(xì)胞尾DNA百分含量、尾距差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但隨劑量增加有升高趨勢。結(jié)論:本研究結(jié)果提示在2D細(xì)胞模型中,EG未導(dǎo)致染色體斷裂及DNA損傷,但3D細(xì)胞模型長期給藥和體內(nèi)重復(fù)給藥結(jié)果均顯示EG存在一定DNA損傷風(fēng)險,故3D HepaRG細(xì)胞模型的評價結(jié)果更接近大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
關(guān)鍵詞 大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷;遺傳毒性;HepaRG細(xì)胞;二維培養(yǎng);三維培養(yǎng);大鼠;微核試驗(yàn)
中圖分類號 R994 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408(2020)01-0018-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.04
ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To evaluate the in vitro and in vivo genotoxicity of emodin-8-O-β-D-glucoside (EG), and to compare the difference of in vitro cell test and in vivo test of rats. METHODS: 2D and 3D hepatocyte models were established by in vitro two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell culture. After modeling, 2D and 3D hepatocyte were divided into blank control group (0.5% DMSO), mitomycin C group (positive control, 0.1 ?g/mL), EG low-dose, medium-dose and high-dose groups (10, 50, 200 ?g/mL), respectively. The micronucleus ratio and tail DNA% of HepaRG cells were detected. SD rats were divided into blank control group (0.5% sodium carboxymethyl cellulose), ethyl methanesulfonate group (positive control, 200? ?mg/kg), EG low-dose, medium-dose and high-dose groups (100, 300, 1 000 mg/kg), with 6 rats in each group. They were given medicine intragastrically for consecutive 15 d, once a day. 15 days later, the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes, the tail DNA% and tail distance of peripheral blood lymphocytes and hepatocytes were measured. RESULTS: In the in vitro 2D HepaRG hepatocyte model, compared with blank control group, the micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell were increased significantly in mitomycin C group (P<0.01). There was no statistical significance in micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell among EG groups (P>0.05). In 3D HepaRG cell model, compared with blank control group, micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell were increased significantly in mitomycin C group (P<0.01 or P<0.001), while tail DNA% of HepaRG cell was increased significantly in EG high-dose group (P<0.01). In the in vivo test, compared with blank control group, the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes, the tail DNA% and tail distance of peripheral blood lymphocytes and hepatocytes were all increased significantly in ethyl methanesulfonate group (P<0.01). Tail DNA% of peripheral blood lymphocytes was increased significantly in EG high-dose group (P<0.01). There was no statistical significance in the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes, the tail DNA% and tail distance of hepatocytes among EG groups (P>0.05); with the increase of dose, there was an increasing trend. CONCLUSIONS: The results of this study suggest that in 2D cell model, EG not lead to chromosome breakage and DNA damage, but the long-term administration and repeated administration in vivo of 3D cell model show that EG has a certain risk of DNA damage, so the evaluation results of 3D HepaRG cell model are more similar to those of rats in vivo.
KEYWORDS? ?Emodin-8-O-β-D-glucoside; Genotoxicity; Two-dimensional culture; Three-dimensional culture; Rat; Micronucleus test
肝臟是人體最主要的代謝及解毒器官,藥源性肝損傷(Drug-induced liver injury,DILI)已成為藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)[1]。隨著近年來臨床不斷出現(xiàn)含蒽醌類成分的中藥致肝損傷的案例報道[2],學(xué)界對蒽醌的肝損傷機(jī)制展開廣泛研究。目前已有體外研究數(shù)據(jù)提示,蒽醌類化合物存在遺傳毒性風(fēng)險和致突變作用[3]。課題組前期研究中也證實(shí)大黃素可誘導(dǎo)正常人源肝細(xì)胞HepaRG染色體損傷和DNA斷裂,在體外彗星及微核試驗(yàn)中呈陽性結(jié)果[4]。蒽醌類的潛在遺傳毒性,尤其是肝臟腫瘤發(fā)生風(fēng)險有待深入探索。
大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷(Emodin-8-O-β-D-glucoside,EG)是大黃素在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物及形式[5],其原型同樣存在于大黃、何首烏、虎杖、決明子、冬凌草等中藥中且含量較高[6]。以何首烏為例,不同產(chǎn)地的何首烏藥材中EG的含量最高可達(dá)0.42%[7]。文獻(xiàn)報道EG可有效提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿含量,保護(hù)神經(jīng)元損傷,對阿爾茨海默病有一定改善,臨床應(yīng)用較為廣泛。然而作為蒽醌類化合物,EG含有的羥基蒽醌結(jié)構(gòu)屬于遺傳毒性警示結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)與DNA堿基類似,使其可嵌入DNA鏈并導(dǎo)致沙門氏菌(尤其是TA1537菌株)回復(fù)性突變[8]。EG的遺傳毒性風(fēng)險不容小覷,但目前關(guān)于EG的毒性及致癌性風(fēng)險缺乏充足的試驗(yàn)研究。
嚙齒類動物在毒性研究中獨(dú)具優(yōu)勢,但是大量開展體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)成本較高且不符合替代毒理學(xué)減少動物使用的理念,因此,使用體外模型進(jìn)行藥物毒性初篩及作用機(jī)制的初步研究十分必要。HepaRG細(xì)胞是從慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌患者體內(nèi)非瘤組織分離而得的細(xì)胞株,能表現(xiàn)人肝細(xì)胞的大多數(shù)功能,其體外二維(Two-dimension,2D)培養(yǎng)模型是常用的體外肝毒性評價工具[9]。本課題組前期研究證實(shí)HepaRG細(xì)胞可在不額外添加代謝活化劑的情況下較好地代謝藥物,在了解以肝臟為靶器官遺傳毒性方面獨(dú)具優(yōu)勢[10]。但2D模型缺乏細(xì)胞-細(xì)胞接觸和細(xì)胞-胞外基質(zhì)間的聯(lián)系,長時間培養(yǎng)會出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象[11]。利用懸滴技術(shù)構(gòu)建的三維(Three-dimension,3D)HepaRG多細(xì)胞聚球體模型則可長期培養(yǎng),并能夠保持較高的白蛋白分泌水平和肝藥酶活性[12],從而更好地模擬藥物體內(nèi)代謝條件,提供更有價值的評價數(shù)據(jù)。
本研究同時利用體外2D、3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型和大鼠體內(nèi)重復(fù)給藥試驗(yàn)評價EG的遺傳毒性,并比較3種評價結(jié)果的差異,以期為EG的臨床合理應(yīng)用和毒性評價方法的選擇提供參考。
1 材料
1.1 儀器
懸滴GravityPlusTM和GravityTRAPTM板(瑞士Insphero 公司);VICTOR X5多功能酶標(biāo)儀(英國Perkin Elmer 公司);5180R臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);NTS-1300恒溫振蕩水槽(東京理化器械株式會社);DYCP-31F電泳儀(北京市六一儀器廠);CX41三目生物顯微鏡(日本Olympus公司);eclipse 80i熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Komet 6.0 圖像分析系統(tǒng)(英國安道爾科技有限公司)。
1.2 藥品與試劑
EG(成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號:17110201,純度:98.0%);甲磺酸乙酯(批號:141970611309162)、細(xì)胞松弛素B(批號:2989720)、二甲基亞砜(DMSO,批號:RNBG7476)均購自美國Sigma-Aldrich公司;磷酸鹽緩沖液(批號:AD19942268)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號:AE27856292)、Giemsa 染料(批號:SLBT6353)均購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶消化液(批號:1974026)、胎牛血清(批號:1908121)均購自美國Gibco公司;絲裂霉素C(日本東京化成株式會社,批號:AKZ8O-EF);羧甲基纖維素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20170830);彗星分析試劑盒(美國Trevigen公司,批號:P191587);Hanks平衡鹽溶液 (美國Corning公司,批號:28417007); SYBR Gold 核酸凝膠染液(美國Invitrogen公司,批號:1987319);吖啶橙(美國Fluka公司,批號:930226)。
1.3 細(xì)胞
HepaRG人源肝細(xì)胞系購自美國Thermo Fisher Scientific公司,本試驗(yàn)所用細(xì)胞為第11~12代。
1.4 動物
SPF級SD大鼠30只,5~6周齡,均為♂。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。在恒溫(20~26 ℃)、恒濕(40%~70%)、各12 h明暗周期的條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)密度為2~3只/籠。提供經(jīng)鈷60放射滅菌的鼠全價顆粒飼料,自由攝食及飲水,取材前不禁食禁水。本研究方案通過國家藥物安全評價監(jiān)測中心實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會(Institutional animal care and use committee,IACUC)審查。
2 方法與結(jié)果
2.1 給藥濃度確定
在96孔培養(yǎng)板中,每孔接種5 000個HepaRG細(xì)胞,孵育18~24 h后給藥。分別設(shè)置空白對照組(0.5% DMSO)和EG給藥組(給藥濃度分別為324、162、81、27、9、3 ?g/mL),于37 ℃,5%CO2的條件下孵育24 h后,即得2D HepaRG細(xì)胞模型,然后每孔加入等體積的三磷酸腺苷檢測試劑,輕輕晃動,室溫平衡10 min后,采用酶標(biāo)儀檢測各孔的三磷酸腺苷發(fā)光強(qiáng)度,并計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(EG各給藥組發(fā)光強(qiáng)度/空白對照組發(fā)光強(qiáng)度)×100%,再根據(jù)濃度與存活率關(guān)系曲線計(jì)算EG 的IC50。結(jié)果,2D HepaRG細(xì)胞模型中EG的IC50為205.4 ?g/mL,因此,將后續(xù)體外2D HepaRG細(xì)胞模型評價試驗(yàn)中的EG高濃度設(shè)置為200 ?g/mL,由于體外3D HepaRG細(xì)胞模型評價試驗(yàn)中的給藥時間長,給藥濃度不應(yīng)高于體外2D HepaRG細(xì)胞模型評價試驗(yàn),為保證EG在不同體外細(xì)胞模型中的可比性,本研究EG在2D、3D HepaRG細(xì)胞模型中給藥濃度保持一致。
2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
微核試驗(yàn)、堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式列出。彗星試驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn);微核試驗(yàn)結(jié)果采用Poisson分布法檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖與統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)GraphPad Prism 7軟件處理生成。
2.3 體外細(xì)胞試驗(yàn)評價EG遺傳毒性
2.3.1 體外2D HepaRG細(xì)胞模型評價EG遺傳毒性
(1)微核試驗(yàn)。調(diào)整HepaRG細(xì)胞濃度為5×105 mL-1,取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔添加2 mL培養(yǎng)液/細(xì)胞混合液,置37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)18~24 h。細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長期時,將其分為空白對照組(0.5%DMSO)、絲裂霉素C組(陽性對照,0.1 ?g/mL)及EG低、中、高劑量組(10、50、200 ?g/mL),處理24 h后更換含細(xì)胞松弛素B(2 ?g/mL)的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)40 h。收獲細(xì)胞并加入0.075 mol/L的氯化鉀溶液2 mL,室溫低滲處理5 min;加入固定液(無水甲醇 ∶ 無水乙酸=3 ∶ 1,V/V)5 mL固定, 1 000 r/min離心5 min,棄上清液,重復(fù)固定2次,每個樣品滴片制備2張標(biāo)本并編號。固定后的玻片標(biāo)本浸入5% Giemsa應(yīng)用液中,染色25~30 min之后置于超純水中沖洗干凈,室溫下自然干燥。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每張玻片標(biāo)本中每500個雙核細(xì)胞中含微核的細(xì)胞數(shù),計(jì)算微核形成率,微核形成率=(含微核雙核細(xì)胞數(shù)/觀察雙核細(xì)胞總數(shù))×100%[13]。
(2)堿性彗星試驗(yàn)。HepaRG細(xì)胞處理及給藥方法同“2.3.1(1)”項(xiàng)下微核試驗(yàn),收獲細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105 mL-1,將收獲的細(xì)胞進(jìn)行制片、裂解、解旋、電泳、中和、脫水等處理后制成單細(xì)胞凝膠標(biāo)本,每組制備3張標(biāo)本。所有標(biāo)本使用SYBR Green I(1 ∶ 10 000)染色,并在熒光顯微鏡下拍照(放大倍數(shù)200~400)。再使用Komet 6.0彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析,每個標(biāo)本至少分析100個彗星細(xì)胞的尾DNA百分含量并計(jì)算中位數(shù)。
結(jié)果,與空白對照組比較,絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高(P<0.01),且其微核形成率和尾DNA百分含量在文獻(xiàn)報道的范圍內(nèi)[13],也表明體外2D HepaRG細(xì)胞模型構(gòu)建成功;EG各劑量組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。體外2D HepaRG細(xì)胞模型的微核形成率及尾DNA百分含量測定結(jié)果見圖1。
2.3.2 體外3D細(xì)胞模型評價EG遺傳毒性
參考盧賢歡等[8]的3D懸滴細(xì)胞模型培養(yǎng)方法構(gòu)建體外3D HepaRG細(xì)胞模型,將HepaRG經(jīng)2%DMSO高密度誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后,接種于GravityPlusTM板以懸滴法培養(yǎng)4 d;待形成肝細(xì)胞微球后加入培養(yǎng)液并將其轉(zhuǎn)移至Gravity TRAPTM板中;隔天換液,連續(xù)培養(yǎng)10 d,即得3D HepaRG細(xì)胞模型;然后分為空白對照組(0.5%DMSO)、絲裂霉素C組(陽性對照,6 ?g/mL)和EG低、中、高劑量組(10、50、200 ?g/mL),連續(xù)給藥3次,每次48 h,最后1次給藥時加入含細(xì)胞松弛素B(6 ?g/mL)的培養(yǎng)基。然后收集各組細(xì)胞,按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行微核試驗(yàn)與堿性彗星試驗(yàn)。
結(jié)果,與空白對照組比較,絲裂霉素C組HepaRG細(xì)胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高(P<0.01或P<0.001),EG高劑量組HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量顯著升高(P<0.01),且隨著EG劑量的增加,3D HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量升高,存在劑量效應(yīng)相關(guān)性;EG各劑量在3D HepaRG細(xì)胞模型微核試驗(yàn)結(jié)果雖為陰性,但微核形成率隨給藥劑量增加有升高趨勢。體外3D HepaRG細(xì)胞模型的微核形成率及尾DNA百分含量測定結(jié)果見圖2。
2.4 大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評價EG遺傳毒性
2.4.1 大鼠分組及給藥
30只大鼠分為空白對照組(0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)、甲磺酸乙酯組(陽性對照,200 mg/kg,給藥劑量參考文獻(xiàn)[14],給藥時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃溶液,甲磺酸乙酯為檢測體內(nèi)DNA斷裂或染色體損傷時最常用陽性對照,故體內(nèi)研究選擇甲磺酸乙酯作為陽性對照)和EG低、中、高劑量組(100、300、1 000 mg/kg,給藥劑量參考文獻(xiàn)[15],給藥時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃溶液),每組6只。連續(xù)灌胃給藥15 d,每天1次,給藥體積為15 mL/kg,末次給藥3 h后所有大鼠以CO2吸入法麻醉,從腹腔后大靜脈取血用于彗星試驗(yàn),采血量約0.5 mL/只。
2.4.2 微核試驗(yàn)
(1)骨髓微核試驗(yàn)。將大鼠處死后,取其單側(cè)股骨,剪斷兩端開放骨髓腔;吸取胎牛血清約1~2 mL,使用注射器針頭沖洗骨髓至試管中,并反復(fù)抽吸針頭數(shù)次吹打制成骨髓細(xì)胞懸液,經(jīng)1 000 r/min離心5 min后,棄去大部分上清液,將骨髓細(xì)胞沉淀吹打均勻;吸取適量骨髓細(xì)胞懸液滴于潔凈玻片上推片,標(biāo)本置于室溫下干燥,再經(jīng)甲醇固定15 min后晾干待檢[14]。每只大鼠骨髓細(xì)胞樣本計(jì)數(shù)200個總紅細(xì)胞中的嗜多染紅細(xì)胞的數(shù)目,以及2 000個嗜多染紅細(xì)胞中含微核細(xì)胞的數(shù)目,分別計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的百分率以及嗜多染紅細(xì)胞的微核形成率。
(2)肝臟微核試驗(yàn)。取大鼠肝左葉約5 mm3大小組織,用刀片切成2~3 mm3小塊,加入含0.05%膠原酶的HBSS溶液,于37 ℃水浴中振搖孵育1 h,每30 min人工用力振搖1次,再用移液器反復(fù)吹打消化后的細(xì)胞懸液50次,再經(jīng)40 μm細(xì)胞篩過濾后,加入3 mL固定液(無水甲醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1,V/V)固定,并以800 r/min離心1 min;棄上清,再次加入3 mL固定液并重懸,樣本于4 ℃條件保存待檢。鏡檢前,取10~20 μL細(xì)胞懸液,加入等體積的吖啶橙-DAPI溶液進(jìn)行熒光染色;染色后,取10~20 μL混合液滴片后加蓋玻片,于熒光顯微鏡下觀察。每只大鼠的樣本計(jì)數(shù)1 000個含微核的肝細(xì)胞,計(jì)算肝細(xì)胞微核率。
結(jié)果,與空白對照組比較,甲磺酸乙酯組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率均顯著升高(P<0.01),EG各劑量組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞/總紅細(xì)胞比例和嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞的微核形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但隨著EG劑量的增加,嗜多染紅細(xì)胞微核形成率及肝細(xì)胞微核形成率均有所增加,存在劑量效應(yīng)相關(guān)性。各組大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞/總紅細(xì)胞比例和嗜多染紅細(xì)胞、肝細(xì)胞微核形成率的測定結(jié)果見表1。
2.4.3 堿性彗星試驗(yàn)
采集大鼠外周血約50 μL備用。肝組織樣本采集肝左葉約2~3 mm3大小組織置于3 mL切碎液(含20 mmol/L EDTA-2Na和10% DMSO的Hanks平衡溶液)中并使用剪刀剪碎組織以釋放細(xì)胞,經(jīng)40 μm細(xì)胞篩過濾后置于冰上備用。取外周血淋巴細(xì)胞和肝細(xì)胞參考“2.3.1(2)”和“2.3.2”項(xiàng)下方法,分別進(jìn)行體外2D、3D細(xì)胞模型的堿性彗星試驗(yàn),測尾DNA百分含量和尾距(尾距=尾DNA百分含量×頭部中心至尾部中心的距離)。結(jié)果,與空白對照組比較,甲磺酸乙酯組大鼠外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞的尾DNA百分含量、尾距均顯著升高(P<0.01),EG高劑量組大鼠外周血淋巴細(xì)胞尾DNA百分含量顯著升高(P<0.01),EG各劑量組大鼠肝細(xì)胞的微核形成率和肝細(xì)胞尾DNA百分含量、尾距差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),由此可知,EG對外周血淋巴細(xì)胞的染色體或DNA損傷效應(yīng)強(qiáng)于肝細(xì)胞。各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞尾DNA 百分含量及尾距的測定結(jié)果見表2。
3 討論
遺傳毒性試驗(yàn)通常平行設(shè)置陽性對照,確保試驗(yàn)體系的可靠性。本研究根據(jù)文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)在體內(nèi)及體外研究中選擇不同陽性對照,證實(shí)試驗(yàn)體系成立、評價結(jié)果可信。絲裂霉素C為體外微核試驗(yàn)常用陽性對照藥,可在非代謝活化條件下誘導(dǎo)微核試驗(yàn)呈陽性結(jié)果[13]。鑒于當(dāng)前針對體外彗星試驗(yàn),尤其是3D模型彗星試驗(yàn)的文獻(xiàn)報道較少,且微核試驗(yàn)所用陽性對照藥及濃度范圍通常可兼顧彗星試驗(yàn),故使用絲裂霉素C同時作為體外微核和彗星試驗(yàn)的陽性對照藥[16]。甲磺酸乙酯是以體內(nèi)染色體和DNA損傷為檢測終點(diǎn)時常用的陽性對照藥,同時也是體內(nèi)彗星試驗(yàn)聯(lián)合驗(yàn)證的指定陽性對照[17],故本研究將其作為體內(nèi)微核和彗星試驗(yàn)的陽性對照。
研究EG的致癌性風(fēng)險對于臨床安全用藥具有重要指導(dǎo)意義。本研究首次同時利用體外2D、3D細(xì)胞模型及大鼠連續(xù)15 d體內(nèi)重復(fù)給藥試驗(yàn)評價EG的遺傳毒性風(fēng)險。體內(nèi)研究在傳統(tǒng)骨髓微核試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加肝微核試驗(yàn),并平行取外周血及肝組織開展彗星試驗(yàn)。肝微核試驗(yàn)可同時考察毒性靶組織及藥物代謝產(chǎn)物的遺傳毒性,尤其在代謝產(chǎn)物體內(nèi)遺傳毒性評價方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[18]。
本研究發(fā)現(xiàn),在體外3D HepaRG細(xì)胞模型中,EG高劑量組HepaRG細(xì)胞的尾DNA百分含量與空白對照組相比顯著升高,且尾DNA百分含量與EG濃度存在明顯的劑量效應(yīng)相關(guān)性;微核試驗(yàn)結(jié)果雖為陰性,但可見類似趨勢。體內(nèi)研究中,盡管EG在傳統(tǒng)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)中呈陰性,但各劑量組微核形成率隨劑量升高有一定升高趨勢,且與肝微核試驗(yàn)結(jié)果基本相符;此外,EG高劑量組可導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞DNA明顯損傷,各劑量組之間呈劑量效應(yīng)相關(guān)性,肝細(xì)胞彗星試驗(yàn)結(jié)果為陰性但可見類似趨勢。2項(xiàng)研究中外周血淋巴細(xì)胞均較肝細(xì)胞更為敏感,可見EG可與外周血淋巴細(xì)胞DNA相互作用,存在一定遺傳毒性風(fēng)險。相關(guān)體外和體內(nèi)研究報道,含蒽醌環(huán)的化合物可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)斷裂、并導(dǎo)致微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)結(jié)果呈陽性,如大黃素可誘導(dǎo)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成率升高[19],可導(dǎo)致體外培養(yǎng)人淋巴母細(xì)胞和肝細(xì)胞DNA斷裂[4,20]。大黃素和大黃酸可誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞tk基因突變率增加[20],蘆薈大黃素在排泄過程中可導(dǎo)致腎細(xì)胞和結(jié)腸細(xì)胞的DNA斷裂等[21]。分析原因認(rèn)為與蒽醌結(jié)構(gòu)可與Topo Ⅱ(Topoisomerase Ⅱ,Topo Ⅱ)的三磷酸腺苷結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合并抑制Topo Ⅱ的活性,從而導(dǎo)致該復(fù)合物不易解離及DNA鏈斷裂 [19]。此外,也有研究顯示,蒽醌類化合物經(jīng)Ⅰ相代謝后其遺傳毒性更強(qiáng),如在體外試驗(yàn)中添加大鼠肝微粒體酶S9后(S9混合物配方中僅含啟動Ⅰ相代謝反應(yīng)的底物),其中蘆薈大黃素可誘導(dǎo)更多回復(fù)性菌落形成[15]。有研究根據(jù)大鼠灌胃EG后,在血漿、尿和糞便樣本中均可檢測到大黃素,推測EG在體內(nèi)先水解為大黃素后再以游離蒽醌形式進(jìn)一步在體內(nèi)代謝[22]。因此,EG體內(nèi)遺傳毒性物質(zhì)基礎(chǔ)可能與分子量較小的含蒽醌母核的化合物有關(guān),該結(jié)論有待經(jīng)體內(nèi)代謝及組織分布研究證實(shí)。
此外,本研究也發(fā)現(xiàn),EG對體外2D HepaRG細(xì)胞模型無明顯致染色體斷裂及DNA損傷風(fēng)險,而3D細(xì)胞模型對其具有明顯損傷,提示體外3D肝細(xì)胞模型的評價結(jié)果更接近于體內(nèi)試驗(yàn)。體外3D肝細(xì)胞模型現(xiàn)已被應(yīng)用于藥物研發(fā)過程中的藥物評估[23-24]。體外3D肝細(xì)胞模型可長期培養(yǎng),且能保持肝狀類似結(jié)構(gòu)和組織代謝活動[25-26],在重復(fù)給藥的體外肝毒性評價方面具有一定的優(yōu)勢。本研究的結(jié)果也表明,體外3D肝細(xì)胞模型是良好的體外毒性評價方法,其評價結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相似,可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行肝毒性藥物的早期篩選。
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(收稿日期:2019-07-01 修回日期:2019-09-16)
(編輯:唐曉蓮)